Top10 giao thức chuyển đổi tế bào có thẩm quyền năm 2022
Để đưa plasmid vào một chủng vi khuẩn Lưu ý: Giao thức này dành cho một dòng tế bào có thẩm quyền khác với mô tả ở trên. Giới thiệuChuyển đổi là quá trình mà DNA nước ngoài được đưa vào một tế bào. Sự biến đổi của vi khuẩn với plasmid rất quan trọng không chỉ đối với các nghiên cứu về vi khuẩn mà còn bởi vì vi khuẩn được sử dụng làm phương tiện cho cả lưu trữ và sao chép plasmid. Do đó, gần như tất cả các plasmid (ngay cả những loại được thiết kế cho biểu hiện tế bào động vật có vú) mang cả nguồn gốc của vi khuẩn và gen kháng kháng sinh để sử dụng làm dấu hiệu có thể lựa chọn ở vi khuẩn. Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều sửa đổi di truyền để tạo ra các chủng vi khuẩn có thể dễ dàng biến đổi hơn và điều đó sẽ giúp duy trì plasmid mà không cần sắp xếp lại DNA plasmid. Ngoài ra, các phương pháp điều trị cụ thể đã được phát hiện làm tăng hiệu quả biến đổi và làm cho vi khuẩn dễ bị biến đổi hóa học hoặc điện hơn, tạo ra những gì thường được gọi là 'tế bào có thẩm quyền'. Nhiều công ty bán các tế bào có thẩm quyền, được đóng băng và được chuẩn bị cho hiệu quả chuyển đổi tối ưu khi tan băng. Để có hiệu quả chuyển đổi cao nhất, chúng tôi khuyên bạn nên làm theo các hướng dẫn đi kèm với các tế bào có thẩm quyền của bạn.For the highest transformation efficiency, we recommend that you follow the instructions that came with your competent cells. * Pro-tip* Các tế bào có thẩm quyền thương mại nằm trong phạm vi đáng kể về hiệu quả chuyển đổi của chúng. Các tế bào hiệu quả thấp nhất (thường là ít tốn kém nhất) là tốt để biến đổi DNA plasmid cho mục đích lưu trữ và khuếch đại. Các tế bào hiệu quả cao hơn là quan trọng hơn nếu bạn sẽ biến đổi với một lượng DNA rất nhỏ hoặc nếu bạn có nhiều plasmid cùng một lúc. Commercial competent cells range significantly in their transformation efficiency. The lowest efficiency cells (usually the least expensive) are fine for transforming plasmid DNA for the purposes of storage and amplification. Higher efficiency cells are more important if you will be transforming with very small amounts of DNA or if you're multiple plasmids at once. * Pro-tip* Để tiết kiệm tiền, nhiều phòng thí nghiệm cũng tạo ra các tế bào có thẩm quyền của riêng họ. Đây là một quy trình tương đối đơn giản và rất hữu ích để thực hiện các phép biến đổi hiệu quả thấp. To save money, many labs also make their own competent cells. This is a relatively simple procedure and is useful for performing low efficiency transformations. & nbsp; & nbsp; Cập nhật lần cuối: ngày 13 tháng 11 năm 2017Last Update: Nov. 13, 2017 Video giao thứcXem video giao thức dưới đây để tìm hiểu cách cô lập các khuẩn lạc vi khuẩn đơn.
Thiết bị
Thuốc thử
Thủ tục
Mẹo và Câu hỏi thường gặpNếu bạn không quan tâm đến hiệu quả chuyển đổi (chẳng hạn như khi bạn có một ống DNA plasmid và chỉ cần biến đổi vi khuẩn để bạn có thể lớn hơn plasmid), bạn có thể tiết kiệm rất nhiều thời gian bằng cách rút ngắn hoặc bỏ qua nhiều bước và Sẽ vẫn có đủ thuộc địa cho bước tiếp theo của bạn. Hãy nhớ rằng mỗi phím tắt này sẽ làm giảm hiệu quả của việc chuyển đổi, vì vậy khi cần hiệu quả cao hơn, hãy tuân theo giao thức hoàn chỉnh.
Các tế bào có năng lực hóa học nhanh chóng và dễ sử dụng, nhưng kém hiệu quả hơn trong việc tiếp nhận các plasmid lớn hơn. Nếu bạn cần biến đổi các plasmid lớn, bạn nên sử dụng các tế bào điện tử. Thay vì dựa vào sốc nhiệt để khiến các tế bào chiếm DNA, trường điện từ được áp dụng cho hỗn hợp tế bào/DNA để tạo ra tính thấm của màng. Để làm điều này, bạn sẽ cần phải có quyền truy cập vào máy điện và các cuvet thích hợp. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất cho mỗi. Kiểm tra xem bạn có mạ trên một tấm thạch LB có chứa kháng sinh chính xác không. Gen kháng trên plasmid của bạn phải khớp với kháng sinh trên đĩa. Bạn cũng nên thêm một biện pháp kiểm soát tích cực (nhiều công ty bao gồm một plasmid kiểm soát tích cực với các tế bào có thẩm quyền của họ) để đảm bảo rằng quy trình chuyển đổi của bạn đang hoạt động. Mặc dù nó có thể phản trực giác, bạn sẽ thường nhận được hiệu quả chuyển đổi cao hơn với ít DNA hơn, đặc biệt là khi sử dụng các tế bào có năng lực cao. Nếu bạn đã sử dụng 100-1000 ng tổng số DNA trong một lần thắt, bạn sẽ thường nhận được nhiều thuộc địa hơn nếu bạn sử dụng 1 μL độ pha loãng 1: 5 hoặc 1:10 thay vì 1 μl trực tiếp. Làm thế nào để 10 tế bào hàng đầu trở nên có năng lực?Chuẩn bị cổ phiếu hạt giống.. Streak Top10 Tế bào trên một tấm nức nở và phát triển cho các khuẩn lạc duy nhất ở 23 ° C. .... Chọn các khuẩn lạc đơn thành 2 ml môi trường nức nở và lắc qua đêm ở 23 ° C. .... Thêm glycerol vào 15%. Các mẫu 1 ml cho nunc cryotubes .. Đặt ống vào túi khóa zip, túi ngâm vào bồn nước đá/ethanol khô trong 5 phút .. Top10 tế bào có thẩm quyền là gì?Các tế bào E. coli Top10 có thẩm quyền đã sẵn sàng cho chuyển đổi sốc nhiệt với DNA vector và sự lan truyền tiếp theo của nó cho mục đích nhân bản và truyền máu. Các tế bào có thẩm quyền hóa học được cung cấp dưới dạng 20 phản ứng một phát riêng biệt. Các tế bào biến đổi có thể được chọn bằng sàng lọc màu xanh/trắng.ready for heat shock transformation with vector DNA and its subsequent propagation for cloning and transfection purposes. The chemically competent cells are provided as 20 separate one-shot reactions. Transformed cells can be selected by blue/white screening.
Các tế bào có thẩm quyền được chuẩn bị như thế nào trong chuyển đổi?Các tế bào có thể được thực hiện có khả năng bằng canxi clorua và điều trị sốc nhiệt.Các tế bào phát triển nhanh chóng có thể được thực hiện dễ dàng hơn so với các tế bào trong các giai đoạn tăng trưởng khác.Các tế bào có thể biểu hiện thông tin di truyền thu được sau khi biến đổi.calcium chloride and heat shock treatment. The cells growing rapidly can be made competent more easily than those in other stages of growth. The cells might express the acquired genetic information after transformation.
Sự khác biệt giữa DH5 Alpha và DH10B là gì?So với DH5A, DNA bị methyl hóa từ việc chuẩn bị bộ gen có thể được chuyển đổi một cách hiệu quả thành DH10B, do đó các tế bào DH10B có thể áp dụng nhiều hơn DH5A trong việc tạo ra các thư viện gen có chứa dư lượng cytosine hoặc adenine bị methyl hóa.Ứng dụng: Hiệu quả chuyển đổi cao nhất.DH10B cells are more applicable than DH5a in generating genomic libraries containing methylated cytosine or adenine residues. Applications: Highest transformation efficiency. |