Thứ tư dụng của thuốc thử nhuộm màu trong nhuộm Gram là gì

Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm do Gram sáng chế năm 1884. Phương pháp này giúp phân biệt vi khuẩn bắt màu Gram [Gram dương] và vi khuẩn không bắt màu Gram [Gram âm], từ đó giúp cho việc chẩn đoán xác định loại vi khuẩn.

Chuẩn bị thuốc thử

• Dung dịch tím Gentian.
• Dung dịch Lugol.
• Cồn tẩy 950.
• Dung dịch đỏ Fuchsin pha loãng 1/10.

Kỹ thuật nhuộm Gram

[1]. Dàn bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên trên lam kính sạch.

[2]. Cố định bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội.

[3]. Nhuộm:

• Phủ dung dịch tím Gentian, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Phủ dung dịch Lugol để cố định màu, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.
• Tẩy mầu bằng cồn 950, để khoảng 30 giây. Rửa nước.
• Phủ dung dịch đỏ Fucshin 1/10 của Gram, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.

[4]. Để khô tự nhiên.

[5]. Soi dưới vật kính dầu.

Nguyên tắc nhuộm

Nhuộm tím Gentian: Nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím đen.

Nhỏ Lugol: Gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tuỳ loại.

Tẩy cồn 950: Tẩy màu một số vi khuẩn mà dung dịch lugol không gắn chắc màu tím vào được. Không tẩy màu một số vi khuẩn mà màu tím đã được dung dịch lugol gắn chắc vào. Bước tẩy cồn rất quan trọng nên phải thật chú ý trong quá trình nhuộm.

Nhuộm đỏ Fuchsin: Nhuộm đỏ trở lại những vi khuẩn đã bị cồn tẩy màu. Không có tác dụng trên vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen.

Cơ chế bắt màu Gram

Có sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram [+] và vi khuẩn Gram [-] về cấu tạo của lớp peptidoglycan [murein] ở thành tế bào vi khuẩn.

Các vi khuẩn Gram [+] có lớp peptidoglycan dày hơn làm cho vi khuẩn giữ chắc màu tím gentian và không bị tẩy màu bởi cồn. Sau khi nhuộm fuchsin, vi khuẩn không bắt màu đỏ mà vẫn giữ nguyên màu tím, đó là vi khuẩn Gram [+].

Các vi khuẩn Gram [-] có lớp peptidoglycan mỏng hơn làm cho vi khuẩn không giữ được màu tím gentian và bị tẩy màu bởi cồn trở thành không màu. Khi nhuộm fuchsin vi khuẩn bắt màu đỏ, đó là vi khuẩn Gram [-].

Đọc kết quả nhuộm Gram

Vi khuẩn Gram [+] bắt màu tím sẫm Gentian: Tụ cầu, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn khuẩn bạch hầu, trực khuẩn than.

Vi khuẩn Gram [-] không bắt màu tím Gentian nên có màu đỏ Fucshin: Lậu cầu, não mô cầu, E. coli, Shigella, Salmonella, tả.

Lưu ý về nguyên nhân nhuộm sai

Gram dương giả

• Do tiêu bản được cố định khi chưa khô, tiêu bản quá dầy.
• Cặn thuốc nhuộm [phải lọc trước khi dùng].
• Đổ chưa hết Lugol.
• Tẩy cồn chưa đủ thời gian.
• Dung dịch fuchsin quá đậm hay nhuộm quá lâu.

Gram âm giả

• Do không thay lugol
• Tẩy cồn quá lâu và tráng không kỹ.

Bệnh viện Bạch Mai

Nhuộm Gram là một trong những kỹ thuật nhuộm quan trọng nhất trong vi sinh vật học. Nó được đặt tên từ nhà vi khuẩn học người Đan Mạch Hans Christian Gram, người lần đầu tiên giới thiệu nó vào năm 1882, chủ yếu để xác định các sinh vật gây ra bệnh viêm phổi. Khi thử nghiệm đầu tiên được thực hiện, phương pháp nhuộm gram vi khuẩn bao gồm việc sử dụng tinh thể tím hoặc xanh methylen làm màu chính.

Thuật ngữ chỉ các sinh vật giữ được màu cơ bản và xuất hiện màu nâu tím dưới kính hiển vi là sinh vật Gram dương. Các sinh vật không bắt màu sơ cấp có màu đỏ dưới kính hiển vi và là các sinh vật Gram âm. Để hiểu rõ hơn về phương pháp này, hãy cùng Docosan tìm hiểu thêm trong nội dung dưới đây.

Tổng quan về phương pháp nhuộm Gram

Bước đầu tiên trong quá trình nhuộm Gram là sử dụng thuốc nhuộm tím pha lê để nhuộm ban đầu cho phiến kính. Bước tiếp theo, còn được gọi là cố định thuốc nhuộm, bao gồm việc sử dụng i-ốt để tạo thành phức hợp i-ốt màu tím tinh thể để ngăn cản việc loại bỏ thuốc nhuộm một cách dễ dàng.

Sau đó, một chất khử màu, thường là dung môi của etanol và axeton được sử dụng để loại bỏ màu nhuộm. Nguyên tắc cơ bản của nhuộm Gram liên quan đến khả năng của thành tế bào vi khuẩn để giữ lại thuốc nhuộm tím tinh thể trong quá trình xử lý bằng dung môi. Vi sinh vật gram dương có hàm lượng peptidoglycan cao hơn, trong khi vi sinh vật gram âm có hàm lượng lipid cao hơn.

Ban đầu, tất cả các vi khuẩn sử dụng thuốc nhuộm màu tím pha lê tuy nhiên, với việc sử dụng dung môi, lớp lipid từ các sinh vật gram âm bị hòa tan. Với sự hòa tan của lớp lipid, gram âm làm mất vết sơ cấp.

Ngược lại, dung môi làm mất nước của thành tế bào gram dương với việc đóng các lỗ chân lông ngăn cản sự khuếch tán của phức hợp iốt tím và do đó, vi khuẩn vẫn bị nhuộm màu. Thời gian khử màu là một bước quan trọng trong quá trình nhuộm gram vì tiếp xúc lâu với chất khử màu có thể loại bỏ tất cả các vết bẩn khỏi cả hai loại vi khuẩn.

Bước cuối cùng trong quá trình nhuộm gram là sử dụng chất nhuộm màu fuchsin cơ bản để tạo cho vi khuẩn gram âm đã khử màu có màu hồng để dễ nhận biết hơn. Nó còn được gọi là phản lưới. Một số phòng thí nghiệm sử dụng safranin như một chất phản công tuy nhiên, fuchsin cơ bản nhuộm các sinh vật gram âm mạnh hơn safranin. Tương tự, ứng dụng Haemophilus spp., Legionella và một số vi khuẩn kỵ khí bắt màu kém với safranin.

Quy trình nhuộm Gram

Khi nào cần chỉ định nhuộm Gram

Nhuộm Gram được chỉ định bất cứ khi nào nghi ngờ nhiễm vi khuẩn để chẩn đoán sớm và dễ dàng.

Mẫu vật

Nhiều bệnh phẩm lâm sàng khác nhau có thể được sử dụng để thực hiện nhuộm Gram. Một số bệnh phẩm thường được sử dụng là đờm, máu, dịch não tuỷ, dịch cổ trướng, dịch khớp, dịch màng phổi, nước tiểu,… Cũng có thể dùng tăm bông ngoáy mũi, họng, trực tràng, vết thương, cổ tử cung. Việc lấy bệnh phẩm phải luôn được đựng trong các vật chứa vô trùng.

Các bước nhuộm Gram

Các loại thiết bị cần thiết để nhuộm Gram

• Đầu đốt Bunsen
• Kính hiển vi làm sạch bằng cồn
• Giá trượt
• Kính hiển vi

Thuốc thử cần thiết để nhuộm Gram

• Màu tím pha lê [vết chính]
• Dung dịch iốt Gram [chất kết dính]
• Axeton / etanol [50:50 v: v] [chất khử màu]
• Dung dịch fuchsin cơ bản 0,1% [chất cản quang]
• Nước

Thực hiện

• Vòng cấy được sử dụng để chuyển một giọt dịch nuôi cấy lơ lửng vào lam kính hiển vi. 
• Nếu đĩa Petri hoặc ống nuôi cấy nghiêng có khuẩn lạc thì một giọt hoặc một vài vòng nước được thêm vào để tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển một lượng khuẩn lạc tối thiểu vào phiến kính kiểm tra. 
• Yêu cầu một lượng nuôi cấy tối thiểu. Nếu mẫu cấy có thể được phát hiện bằng mắt thường trên vòng cấy, điều đó cho thấy việc thu thập quá nhiều mẫu cấy.
• Nuôi cấy được trải bằng một vòng cấy vào một màng mỏng đều trên một vòng tròn có đường kính 15mm. Một phiến kính điển hình có thể chứa tối đa 4 vết bẩn nhỏ nếu kiểm tra nhiều hơn một mẫu cấy.
• Bản chiếu có thể được làm khô bằng không khí hoặc làm khô với sự trợ giúp của nhiệt trên ngọn lửa nhẹ. Slide phải được di chuyển theo hình tròn trên ngọn lửa để tránh quá nhiệt hoặc hình thành các mẫu vòng trong slide. Nhiệt giúp kết dính tế bào vào lam kính và ngăn ngừa sự mất mát đáng kể của chất nuôi cấy trong quá trình rửa.

• Màu tím pha lê được thêm vào trên môi trường nuôi cấy cố định. 
• Sau 10 đến 60 giây, vết bẩn sẽ được đổ ra và rửa sạch vết bẩn thừa bằng nước. Mục đích là rửa sạch vết bẩn mà không làm mất đi lớp cấy cố định. 
• Dung dịch iốt được sử dụng để che vết bẩn trong 10 đến 60 giây. Bước này được gọi là “cố định thuốc nhuộm”. Dung dịch iốt được đổ ra và rửa phiến kính bằng nước đang chảy. Nước thừa từ bề mặt được rũ bỏ.
• Một vài giọt chất khử màu được thêm vào trang trình bày. Chất khử màu thường là dung môi hỗn hợp của etanol và axeton. Bước này được gọi là “xử lý dung môi”. Trượt được rửa sạch bằng nước trong 5 giây. Để ngăn chặn sự khử màu quá mức trong các tế bào gram dương, hãy ngừng thêm chất khử màu ngay khi dung môi không có màu khi nó chảy qua phiến kính.
• Vết bẩn được trộn với dung dịch fuchsin cơ bản trong 40 đến 60 giây. Dung dịch fuchsin được rửa sạch bằng nước và nước thừa sẽ được thấm bằng giấy bibulous. Tấm trượt cũng có thể được làm khô bằng không khí sau khi rũ bỏ nước thừa. 

• Các phiến kính phải được kiểm tra dưới kính hiển vi trong điều kiện ngâm trong dầu.
• Việc kiểm tra phiến kính ban đầu nên sử dụng vật kính X40 để đánh giá sự phân bố vết bẩn, và sau đó chúng nên được kiểm tra bằng vật kính ngâm dầu X100.
• Tất cả các khu vực của slide yêu cầu kiểm tra ban đầu. Nên kiểm tra những vùng chỉ dày một ô. Các vùng dày trong các trang chiếu thường cho kết quả thay đổi và không chính xác. 
• Bạch cầu và đại thực bào nhuộm Gram âm.
• Tế bào biểu mô vảy nhuộm Gram dương.

Các phương pháp nhuộm Gram khác nhau được sử dụng, chẳng hạn như nhuộm Gram Atkin, và nhuộm Gram Burke, v.v.

Chẩn đoán kết quả

Nhuộm Gram là phương pháp giúp hỗ trợ chẩn đoán bệnh hoặc tình trạng bệnh lý. 

Ví dụ về các sinh vật gram dương là: 

• Cocci: Các loài Staphylococcus và các loài Streptococcus
• Trực khuẩn: Loài Corynebacterium, loài Clostridium và loài Listeria

Ví dụ về các sinh vật gram âm là:

• Cocci: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis và các loài Moraxella
• Trực khuẩn: Escherichia cuộn, loài Pseudomonas, loài Proteus và loài Klebsiella

Ví dụ về các sinh vật biến đổi gram bao gồm:

Một kết quả bình thường trong dịch cơ thể vô trùng phải là không có bất kỳ sinh vật bệnh lý nào trong vết phết. Các sinh vật được xác định dựa trên màu sắc và hình dạng.

• Gram âm bắt màu gì?
  • Các sinh vật Gram dương có màu tím hoặc xanh lam
• Gram dương bắt màu gì?
  • Các sinh vật Gram âm có màu hồng hoặc đỏ
• Trực khuẩn có hình gì?
• Cầu khuẩn có hình gì?

Các phát hiện trên vết nhiễm khuẩn Gram gợi ý các bệnh nhiễm trùng cơ bản:

• Cầu khuẩn Gram dương thành từng đám: Thường là đặc trưng của các loài Staphylococcus như S. aureus
• Cầu khuẩn gram dương dạng chuỗi: Thường đặc trưng cho các loài liên cầu như S. pneumoniae, liên cầu nhóm B
• Cầu khuẩn Gram dương trong bệnh uốn ván: Thường là đặc trưng của Micrococcus spp
• Trực khuẩn Gram dương, dày: Thường là đặc trưng của Clostridium spp., Như C. perfringes , C.nticum
• Trực khuẩn Gram dương, gầy: Thường đặc trưng của Listeria spp
• Trực khuẩn gram dương phân nhánh: Thường đặc trưng cho Actinomyces và Nocardia
• Song cầu khuẩn gram âm: Thường là đặc trưng của Neisseria spp., Chẳng hạn như N. meningitidis
• Coccobacilli: Thường là đặc trưng của Acinetobacter spp., Và chúng có thể là gram dương, gram âm hoặc gram biến đổi
• Trực khuẩn gram âm, gầy: Thường đặc trưng của họ Enterobacteriaceae , như E. coli
• Coccobacilli: Thường là đặc trưng của Haemophilus spp chẳng hạn như H. influenzae
• Cong: Thường là đặc trưng của Vibrio spp.; Campylobacter spp chẳng hạn như V. cholerae và C. jejuni
• Hình kim mỏng: Thường là đặc trưng của Fusobacterium spp
• Các sinh vật biến đổi Gram: những sinh vật này không phân nhóm thành sinh vật Gram dương hoặc Gram âm

Nhuộm Gram thường là xét nghiệm chẩn đoán ban đầu để đánh giá tình trạng nhiễm trùng. Việc sử dụng phương pháp nhuộm Gram tạo điều kiện nhanh chóng cho việc sử dụng kháng sinh thích hợp. Tuy nhiên, trình tự gen và kỹ thuật phân tử đặc hiệu hơn so với nhuộm gram cổ điển.

Bài viết được tham khảo từ bác sĩ và các nguồn tư liệu đáng tin cậy trong và ngoài nước. Tuy nhiên, Docosan Team khuyến khích bệnh nhân hãy tìm và đặt lịch hẹn với bác sĩ có chuyên môn để điều trị. Để được tư vấn trực tiếp, bạn đọc vui lòng liên hệ hotline 1900 638 082 hoặc CHAT để được hướng dẫn đặt hẹn.

Nguồn tham khảo: ncbi