Tại sao phải tránh tạo bọt khí trong quá trình đổ gel

Hình 1: Cung cấp chất phá bọt thực phẩm dùng trong công nghiệp thực phẩm

Lên men là một quá trình trong đó tăng trưởng và nuôi cấy vi sinh vật [hoặc tế bào động vật và thực vật] được thực hiện để gây ra những thay đổi hóa học và sinh lý, từ đó tạo ra và tích lũy một lượng lớn chất chuyển hóa cần thiết cho quá trình lên men. Nghề thủ công cổ xưa này đã có thể sản xuất thực phẩm lên men và thuốc trên quy mô lớn ngày nay. Tuy nhiên, nó thường dễ tạo bọt trong quá trình lên men. Một khi bọt không được kiểm soát, nó sẽ gây ra sự hư hỏng và nấm mốc của các sản phẩm lên men. Chất khử bọt lên men được đặt hàng bởi các nhà sản xuất trong ngành công nghiệp lên men.

LÝ DO BỌT HÌNH THÀNH TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN

- Vi sinh vật đang được hô hấp yếm khí.

- Cùng tồn tại hai pha khí-lỏng.

- Trộn không đúng cách.

- Môi trường giàu chất dinh dưỡng, bổ sung thêm hô hấp vi sinh vật.

- Quá trình lên men nóng lên quá nhanh.

LÀM THẾ NÀO ĐỂ LOẠI BỎ BỌT TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN

1. Phương pháp khử bọt vật lý:

- Tăng sự khuấy trộn của thiết bị lên men để phá hủy các bong bóng [sử dụng khi bọt quá nhiều].

- Tăng áp suất bể thích hợp.

- Giảm tốc độ lên men.

2. Phương pháp khử bọt hóa học:

- Giảm dinh dưỡng của môi trường

- Bổ sung nguồn C, nguồn N, muối vô cơ, cơ chất để tạo ra enzyme

- Sử dụng chất khử bọt/chống tạo bọt

LÀM THẾ NÀO ĐỂ CHỌN MỘT CHẤT KHỬ BỌT/CHỐNG TẠO BỌT CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN

- Có thể chịu được nhiệt độ cao.

- Không độc hại và không vị.

- Tốc độ khử bọt nhanh.

- Có khả năng chống tạo bọt lâu dài.

- Không ảnh hưởng đến sản phẩm.

Sản phẩm phụ gia khử bọt/phá bọt/chống tạo bọt trong thực phẩm của Mdi Chemical hoàn toàn đáp ứng các đặc điểm trên. Không những vậy sản phẩm của chúng tôi còn giải quyết các vấn đề bọt khác nhau trong sản xuất và chế biến thực phẩm, thuốc,…

Với gần 20 năm kinh nghiệm cung ứng hóa chất và phụ gia đặc chủng trên thị trường Việt Nam, MDI đã được nhiều khách hàng ủng hộ và công nhận. MDI với nhóm các kỹ sư hóa chất giàu kinh nghiệm và nhiệt huyết sẽ tư vấn kỹ lưỡng cho khách hàng về các vấn đề về phụ gia trong công nghiệp và thực phẩm. Nếu Quý Khách hàng có bất kỳ nhu cầu về sản phẩm chống bọt/khử bọt/kháng bọt Quý khách có thể gọi trực tiếp đường dây nóng của chúng tôi theo số +84 028 6256 5573 hoặc Hotine: 0902 100 571.

Tham khảo:

Chất phá bọt dùng trong thực phẩm:

Tags:

công ty Concentrol, mdi, công ty mdi, mdi chemical, công ty hóa chât, mua bán hóa chất, phụ gia thực phẩm, chất phá bọt, chất kháng bọt, phụ gia chống tạo bọt thực phẩm, antifoam, defoamer, mdi chemical, thế giới chất phá bọt

Quý khách hàng cần hỗ trợ tư vấn về sản phẩm xin vui lòng liên hệ:

CTY TNHH ĐẦU TƯ VÀ PHÁT TRIỂN THỊ TRƯỜNG HÓA CHẤT

[Mdi Chemical Co., Ltd]

Email:

Web: www.mdi.vn

Hotline: 0902 100 571

Loading Preview

Sorry, preview is currently unavailable. You can download the paper by clicking the button above.

Chương 3- Kỹ thuật điện diCHƯƠNG III – KỸ THUẬT ĐIỆN DIPhương pháp điện di là phương pháp rất phổ biến trong phân tích sinh hóa,được dùng trong phân tích nucleic acid và protein. Kỹ thuật điện di rất có nhiềuứng dụng trong sinh học phân tử. Đây là một bước không thể thiếu trong các kỹthuật như PCR [Polymerase Chain Reaction], AFLP [Amplified Fragment LengthPolymorphism]…1 - Nguyên tắc điện diKỹ thuật điện di được sử dụng nhằm tách và so sánh kích thước của cácphân tử protein, nucleic acid. Sự so sánh này dựa trên tốc độ di chuyển của cácphân tử trong môi trường điện di.Trong một điện trường, các phân tử tích điện thuộc pha lỏng sẽ di chuyểnvề phía các cực. Vận tốc di chuyển của các phân tử này sẽ tùy thuộc sự tỷ lệ giữađiện tích và khối lượng của chính các phân tử này. Như vậy giữa các phân tử cócùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về các cực ngượcdấu nhanh hơn.p dụng nguyên lý trên, trong kỹ thuật sinh hóa và sinh học phân tử, ngườita sử dụng kỹ thuật điện di nhằm phân tích protein hay phân tích nucleic acid.Điện di trong môi trường lỏng không có ý nghóa trong thực tế. Điện dithường được tiến hành trên những giá thể bán rắn gọi là các gel. Các gel này làmôi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử protein hay nucleic acid điqua. Kích thước phân tử càng lớn thì sự di chuyển của phân tử qua gel càng chậm.Có hai loại gel được sử dụng chủ yếu trong điện di là gel agarose và gelpolyacrylamide. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tuỳthuộc kích thước của các phân tử cần tách.2 - Điện di trên gel polyacrylamide [PAGE]+ Cho hiệu suất phân giải cao cho những nucleic acid và protein có kíchthước nhỏ và trung bình [trọng lượng phân tử xấp xỉ đến 1.106 Da].+ Cho phép phân tách khối lượng mẫu lớn.+ Giảm thiểu sự tương tác giữa phân tử di chuyển với chất nền+ Tính hợp lý của chất nền.Kích thước lỗ gel thay đổi nhờ nồng độ của gel.Polyacrylamide được chuẩn bò bằng sự polymer hóa giữa acrylamide và N,`N -methylen-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được kiểm soát bởi một chấtxúc tác cảm ứng là –N-N, N`, N` tetramethylethylendiamin [TEMED]. Quá trìnhquang hóa polymer hóa còn có thể được thúc đẩy bởi sự có mặt của tia UV. Nồngđộ gel tiêu chuẩn cho phân tích protein là 7.5% polyacrylamide. Nó còn có thểphân tích phân tử có khối lượng dao động từ 10.000-1.000.000 Da. Tuy nhiên hiệuBÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI6Chương 3- Kỹ thuật điện disuất phân tích tốt đối với phân tử từ 30.000 -300.000 Da. Hiệu suất phân giải vàkhoảng khối lượng phân tử của cấu tử phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide vàbis-acrylamide.Nồng độ gel thấp hơn sẽ cho lỗ gel lớn hơn, cho phép phân tích những phântử sinh học có khối lượng lớn hơn. Ngược lại nồng độ cao hơn của acrylamide sẽcho lỗ gel nhỏ hơn.Điện di trên gel polyacrylamide có thể dùng cho điện di trên cột gel hayđiện di trên bản gel.Hình II.1 – Điện di trên cộtHình II.2 – Điện di đứngNếu điện di trên cộtỐng thuỷ tinh [10cm6mm] được nạp đầy acrylamide; N, N` -methylen-bisacrylamide, đệm và xúc tác. Quá trình polymer hóa xảy ra từ 30-40 phút. Cột gelđược đặt vào trong một điện trường. Đầu trên là catod và đầu dưới là anod. Mẫuđem phân tích được nạp vào trên đầu cột, phía cực catod. Mẫu sẽ được phân táchthành từng lớp trên gel, và dòng điện được đặt vào. Một mẫu thuốc nhuộm dùngđể đánh dấu đường đi của các cấu tử cũng được nạp vào và tốc độ di chuyển củanó song song với mẫu và nhanh hơn mẫu một chút. Khi mẫu thuốc nhuộm đã dichuyển ra khỏi mẫu, tắt nguồn điện, gel được lấy ra khỏi cột và tiến hành nhuộâmmẫu.Một kiểu điện di của của gel polyacrylamide là điện di trên bản gel mà phổbiến nhất là bản gel đứng.Gel polyacrylamide được chuẩn bò và cho vào giữa hai miếng kính. Khoảngcách giữa hai miếng kính phổ biến từ 0.5-2.0mm. Bề mặt lớp gel có diện tích là2040cm và có thể cùng một lúc phân tích nhiều mẫu. Một lượt gel được đặt vàođầu trên của bản gel trong quá trình polymer hóa. Sau khi gel đông đặc, lấy lượtBÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI7Chương 3- Kỹ thuật điện dira ta sẽ có giếng gel dùng để nạp mẫu. Một lượt có thể tạo ra cùng một lúc 20giếng. Nạp dung dòch mẫu vào giếng, cắm nguồn điện và bắt đầu điện di.Trong sinh học phân tử PAGE dùng để phân tích DNA có kích thướcnhỏ.Thường từ 1-500 bp. Bảng mức nồng độ gel khác nhau và khả năng phântách:Nồng độ polyacrylamide[%]Xếp thứ tự dsDNA [bp]3.5100-1000575-5007.550-40010.035-25015.020-15020.05-100Bảng II.1- Thành phầøn phối hợp với gel polyacrylamide [pha 100ml]Nồng độTpAcrylamide [g]Bis [g]TEMED [g]Dung dòch phastock [ml]Nước [ml]Amomiumpersulphate10% [ml]3.55.07.510.015.020.03.240.260.1104.70.30.1107.130.370.1109.60.40.11019.550.450.11019.50.50.11086.41.084.91.082.41.079.91.074.91.069.41.0Dung dòch pha stock 10X cho 1lítBufferTBE: 108.0 Tris base; 55.0 g boric acid; 93.0 g EDTA, pH 8.2TAE: 48.4 g Tris base; 11.4ml glacial acetic acid; 20ml EDTA 0.5, pH 7.6TPE: 108.8 g Tris base, 15.5 ml phosphoric acid 85%; 40.0ml EDTA 0.5,pH 8.0.PAGE được dùng rất nhiều trong phân tích.+ Phương pháp chuẩn bò gel polyacrylamide1. Chuẩn bò số lượng gel cần, tuỳ theo kích thước khay đựng gel2. Tính tóan số lượng phản ứng cần theo bảng3. Hoà số lượng Acrylamide và Bis [chú ý mang găng tay vì hóa chất rấtđộc] vào nước buffer, thêm TEMED.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI8Chương 3- Kỹ thuật điện di4. Ngay tức khắc cho vào amonium persulphate5. Đặt lược lên khay gel.6. 30 phút sau lấy lượt ra khỏi gel và chuẩn bò cho chạy điện di+ Phương pháp nạp mẫuTrộn mẫu vào dung dòch nạp mẫuCó thể sử dụng Bromophenol blue: 0.25Glycerol 10% thể tíchTác dụng của Bromophenol blue: có màu xanh để thấy vạch điện di.Glycerol: có tỷ trọng lớn hơn nước, để mẫu chìm xuống giếng gel.3 - Điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide [SDS - PAGE]Kỹ thuật điện di trước không có thể đo khối lượng phân tử của đại phân tửsinh học bởi vì nó phụ thuộc vào cả hai yếu tố là điện tích và kích thước phân tử.Nếu có một phương pháp nào đó loại bỏ ảnh hưởng bởi điện tích của protein [mộtđại phân tử sinh học phổ biến] thì trong khi điện di, tốc độ di chuyển của các đạiphân tử chỉ phụ thuộc vào kích thước phân tử. Người ta thường dùng một chất tẩymạnh để xử lý protein. Trong phương pháp này các protein được phản ứng vớichất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS [Sodium Dodecyl sulfate] để tạomột phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về phía cực dương của điệntrường. Thêm vào đó một chất khử là mercaptoethanol hoặc dithireitol [DDT] đểphá vỡ cầu nối –S-S- của protein [và các tiểu đơn vò của chúng]. Nhờ đó sự dichuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộcvào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn nhữngphân tử có kích thước nhỏ khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất đònh.Trong thí nghiệm, protein chưa biết khối lượng và cấu trúc các tiểu đơn vòđược xử lý vơi 1% SDS và 0.1M mercaptoethanol trong dung dòch điện di. Mộthỗn hợp protein chuẩn đã biết trước khối lượng phân tử cũng được cho chạy điệndi với cách xử lý và điều kiện như trên. Hai bản chuẩn điện di, một bản ứng vớinhững phân tử protein có khối lượng phân tử thấp [từ 14.000-100.000 Da], mộtbản ứng với những phân tử protein có khối lượng phân tử cao [45.000-200.000Da].SDS-PAGE thì hiệu quả trong xác đònh khối lượng phân tử của các phân tửprotein đơn vò. Là phương pháp điện di trên gel được dùng phổ biến nhất trongviệc xác đònh kích cỡ và những thành phần khác nhau của một phân tử protein.SDS-PAGE giới hạn xác đònh khối lượng phân tử từ 10.000-200.000 Da. Gel cóhàm lượng acrylamide nhỏ hơn 2.5% có thể dùng để điện di protein có khối lượngphân tử lớn hơn 200.000 Da. Nếu protein có khối lượng phân tử trung bình ngườita thường dùng hỗn hợp giữa gel agarose và polyacrylamide.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI9Chương 3- Kỹ thuật điện diThực hànhHoá chất và dụng cụ+ Dụng cụ:Bộ nguồn điện di, hộp điệndi, dụng cụ làm gel [tấm kính,lược, kẹp…] pipet, máy khuấy từ,máy hút chân không.Cấu tạo của một khung gelGel được chuẩn bò trongmột khoảng hẹp được tạo thànhbởi hai miếng kính, phân cáchnhau bởi một tấm đệm bằng chấtdẻo hoặc nguyên liệu thích hợp.Miếng đệm dài hơn tấm kínhkhoảng1cm chiều rộng và độ dàykhoảng 0.5mm. Các giếng nơimẫu cho vào được tạo thành từHình II.3 – Phương pháp SDS -PAGE một mẫu lượt chạy dài ngang đỉnh gelcó cùng chiều dày với miếng đệm. Cácrăng lược dài khoảng 1cm, rộng 2-10mm. Khoảng cách giữa các răng 3mm.+ Hoá chất1. Dung dòch Acrylamide hay dung dòch đơn hợpAcrylamide [FW 71.08]:30gBis-acrylamide [FW 154.2] :0.8gCho nước đến 100ml. Bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong nơi tối. Dung dòch nàyđộc có khả năng gây ung thư cho nên phải mang găng tay khi làm thí nghiệm.2. Đệm gel phân tách [stocking separating gel] hay 4X đệm gel lỏng [1.5MTris HCl , pH 8.8]Hoà tan 3.36g Tris [FW 121.1] trong 15ml nướcChỉnh pH 8.8 bằng HCl 4N3. Đệm stacking gelHoà tan 1.5g Tris [FW 121.1] trong 20ml nướcChỉnh pH 6.8 bằng HCl 4NThêm nước cho đủ 25ml. Bảo quản nơi tối ở 4oC trong ba tháng.4. Dung dòch SDS 10% [có thể bảo quản trong 6 tháng]5. Dung dòch amonium persulfate 10% [dùng trong ngày]6. TEMED7. Dung môi pha mẫuBÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI10Chương 3- Kỹ thuật điện diĐệm stacking gel2.5mlDung dòch SDS 10%4mlGlycerol2mlBromophenol blue2mg-mercaptoethanol1mlDẫn nước đến 10ml, bảo quản ở –20oC trong 6 tháng.8. Gel phủ lỏng [0.375M Tris –HCl, 0.1% SDS, pH 8.8]Đệm stacking gel25mlSDS 10%1mlDẫn nước đến 100ml, bảo quản ở nhiệt độ 4oC ở nơi tối trong 3 tháng.9. Đệm điện diTris [FW 121.1]3.028gGlycine14.413gSDS1gDẫn nước đến 1000ml. Dung dòch không cần kiểm tra lại pH, bảo quản trênmột tháng ở nhiệt độ phòng.10. n-butanol bão hoà nướcn-butanol50mlNước5ml11.Dung dòch nhuộm proteinCoomassale blue G-2500.6gAcetic acid100mlThêm nước cho đủ 1000ml. Dung dòch chứa trong hai có màu, bảo quản ởnhiệt độ phòng.12.Dung dòch rửa màuAcetic acid70mlMetanol50ml13.Dung dòch cố đònh màu nhanhIsopropanol250mlAcetic acid100mlThêm nước cho đủ 1000ml.Tiến trình thực hiện theo các bước+ Bước 1: Chuẩn bò mẫuMẫu khô hoặc dung dòch được hoà tan trực tiếp trong dung môi pha mẫu saocho có nồng độ 0.5-1.5mg protein/ml. Đun sôi cách thuỷ trong 5 phút. Để nguội.+ Bước 2: Chuẩn bò gel để chạy điện diTrước hết ta cần biết chiều dài, chiều rộng hay chiều dày của khung gel đểcó thể tính được thể tích gel cần pha chế để tránh lãng phí.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI11Chương 3- Kỹ thuật điện diGiả sử cần thiết điều chế 30ml dung dòch gel để điện di, phải cần các dungdòch gốc theo tỷ lệ sau.Bảng II.2 - Pha chế hỗn hợp gel điện diNồng độ [%]57.51012.515Dd acrylamide [ml]57.51012.515Đệm gel stacking [ml]7.57.57.57.57.5SDS 10% [ml]0.30.30.30.30.3Nước [ml]17.114.6129.67.1Cho vào một erlen có nhánh nối với một máy hút chân không. Vừahút vừa khuấy bằng máy khuấy từ cho đến khi hết bọt khíAmonium persulfate [l] 150150150150150TEMED [l]1010101010Lắc nhẹ cho tan hết.+ Bước 3: cho gel điện di vào khuôn đúc gelCho gel đặc vào khuôn đúc gel, cho đến khi cách răng lược khoảng 3-5mm.Đổ trên mặt của gel đặc 300 l n-butanol bão hòa để tránh hiện tượng oxyhóa làm ngăn cản sự polymer hóa của gel.Sau 1-2 giờ, sau khi gel đã polymer hóa xong và đông đặc lại, nghiêng đổn-butanol ra ngoài, tráng ngay lại bằng dung dòch phủ gel lỏng [khoảng 0.3ml].Thêm vào 0.5ml dung dòch phủ lỏng để cố đònh gel.+ Bước 4: Chuẩn bò gel stackingĐể có 10ml dung dòch gel stacking, tiến hành như sau:Dung dòch acrylamide 1.32mlĐệm stacking2.49mlSDS 10%99mlNước6.09mlKhuấy từ và hút chân không để loại bọt khí.Amonium persulfate50.1mlTEMED4.95mlLắc nhẹ và cho tan hết+ Bước 5: Điện diCho dung dòch phủ trên gel điện di và cho 0.5ml gel stacking vừa điều chếxong để tráng bề mặt của gel. Đổ bỏ.Cho đầy gel stacking vào và đặt lược vào để tạo thành các giếng. Chú ýkhông để tạo các bọt khí. Để gel cố đònh ít nhất trong 60 phút.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI12Chương 3- Kỹ thuật điện diNhẹ nhàng lấy lược ra khỏi gel, tránh làm hỏng các vách ngăn cách. Tránglại giếng bằng dung dòch điện di. Bơm 5-10l có nồng độ khoảng 1g/l mẫu đãđược xử lý bằng dung dòch pha mẫu vào giếng. Đóng điện và tiến hành điện di.+ Bước 6: Nhuộm và đọc kết quảĐặt gel trong dung dòch cố đònh màu nhanh trong 30 phút, thỉnh thoảng lắcnhẹ.Chuyển gel qua dung dòch nhuộm protein trong vài giờ, thỉnh thoảng lắcnhẹ đến khi nào vạch màu hiện lên.Cuối cùng cho gel vào dung dòch tẩy màu, dung dòch này được thay hai lầntrong một ngày đến khi này gel trong.Gel hoàn tất có thể được bảo quản trong acetic acid 7% hoặc trong nước.4 - Điện di trên gel agaroseNhững kỹ thuật điện di được nghiên cứu ở trên đây chủ yếu dùng để phântích protein và những nucleic acid nhỏ, có khối lượng phân tử tới 350.000 Da[500bp]. Tuy nhiên, những lỗ nhỏ trong gel thì không có thể phân tích được nhữngcấu phần nucleic acid có khối lượng phân tử cao hơn. Phương pháp chuẩn dùng đểphân tích RNA và DNA có số nucleic từ 200-50.000 bp là điên di với gel agarosevới nồng độ trung bình.Hình II.4: Cấu trúc agarose [theo Nông Văn Hải 2002]Agarose là một hợp chất được chiết xuất từ tảo biển, là một loại polymermạch thẳng của galactose pyranose. Gel được chuẩn bò bằng cách hòa tan agarosetrong dung dòch điên di có nhiệt độ ấm. Sau đó làm ấm hỗn hợp gel đến 50oC, hỗnhợp gel được đổ giữa hai tấm kính, tương tự như trong cách đổ gelpolyacrylamide.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI13Chương 3- Kỹ thuật điện diHình II.5 Các bước tạo gel điện di agarose1,2 Tạo khuôn-3 Đổ gel vào khuôn-4 lắp lược, tra mẫu-5 chạy điện diMẫu được đặt vào giếng gel [tạo ra bởi lược gel] và điện áp được đặt vàohai đầu.Gel agarose được đỗ lên một giá thể nằm ngang. Điện di được thực hiệntheo phương ngang.Các nucleic acid trong gel agarose sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại nhờmột hóa chất có tên là ethidium bromide. Chất này có chức năng gắn xen vàogiữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnhquang. Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ. Sau điệnBÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI14Chương 3- Kỹ thuật điện didi gel được chiếu bằng tia tử ngoại [bước sóng 300nm]. Nuleic acid sẽ hiện hìnhdưới các vệt màu đỏ cam.Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gelagarose. Người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử”. Đó là mộttập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết [thang DNA], thông thườngngười ta sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể  được thuỷ giải bởi enzyme cắtgiới hạn Hind III.Một hệ thống điện di mới Instacry, được giới thiệu bởi Eastman Kodak, gầnnhư có thể được thay thế cho agarose gel. Instacryl H Copolymer, là một loạipolymer có sự hiện diện của dithioreitol. Nồng độ gel từ 3-6% có thể được dùngđể phân tách DNA mạch đôi từ 10-3500bp.5 - Điện di trong điện trường xungTrong lý thuyết, điện di trên gel agarose được dùng để phân tích nucleicacid có trình tự nhỏ hơn 50.000bp. Trong thực tế, chúng chỉ có thể phân tích tốttrong giới hạn 20.000-30.000bp. Và những DNA có kích thước lớn hơn 50kb thìquá lớn để có thể chui qua lỗ gel. Từ lúc DNA ribosome của đa số các sinh vật cókích thước lên đến hàng ngàn đến hàng triệu bp. DNA muốn điện di được phải cắtngắn bằng enzyme cắt giới hạn và sau đó được phân tách bằng điện di thôngthường. Trong những năm đầu những năm 1980, Schawarts và Cantor tại đại họcColumbia [Mỹ], đã phát hiện rằng những DNA có kích thước phân tử lớn [nhưnhân nấm men- kích thước từ 200-3000kb] có thể phân tách bằng điện di trongđiện trường xung [PFGE]. Phương pháp này về cơ bản giống như trong điện dithông thường. Trong điện di trong điện trường xung, hướng của điện trường khôngphải cố đònh như phương pháp thông thường và được thay đổi theo chu kỳ, cả lựcđiện trường cũng được thay đổi. Mỗi lần hướng của điện trường thay đổi thì phântử DNA phải tự đònh hướng lại. Thời gian cho việc tự đònh hướng này phụ thuộckích thước của phân tử. Phân tử càng dài thì thời gian tự đònh hướng càng lớnkhiến nó di chuyển chậm hơn một phân tử có kích thước nhỏ.Mặc dù theo lý thuyết, PFGE được sử dụng ít, nhưng trong thực tế nó đượcáp dụng rất nhiều. PFGE đã thay đổi rất lớn kỹ thuật nghiên cưú DNA. NhữngDNA có trọng lượng phân tử trung bình, được cô lập khỏi tế bào dưới sự hiện diệncủa lysozyme, chất tẩy và EDTA có kích thước phân tử khoảng 400-500kb đượcphân tách tốt bởi kỹ thuật điện di trong điện trường xung.Có nhiều thiết bò được phát triển để thay đổi thiết kế thí nghiệm của PFGE.Một vài yếu tố có thể bò thay đổi trong mỗi thí nghiệm như hiệu điện thế, sốlượng điện cực, chu kỳ thay đổi hướng điện trường, thiết kế hộp gel, nhiệt độ,nồng độ agarose, pH của dung dòch điện di, thời gian điện di.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI15Chương 3- Kỹ thuật điện diCũng giống như các kỹ thuật thí nghiệm khác, PFGE cũng có một số nhượcđiểm cần phải được lưu ý ví dụ như thời gian điện di lâu [trong vòng vài ngày]thường đòi hỏi sự phân giải tốt. Sự di chuyển của những cấu phần phụ thuộc vàođiều kiện tiến hành thí nghiệm.PFGE là công cụ hiệu quả trong việc phân tách những phân tử có khốilượng rất lớn. Kỹ thuật này đã được sử dụng trong dự án bộ gen người.6 - Điện di trên giấyNguyên liệu, hoá chất và thiết bò+ Nguyên liệu: dung dòch amin chuẩn, hỗn hợp M1, dung dòch nghiên cứu.+ Hoá chất: dung dòch điện di: dung dòch đệm phosphate M/5 pH 6.1.+ Thiết bò: giấy điện di [giấy Whatman No 1]Máy điện di gồm: hai chậu lớn, hai miếng kính thuỷ tinh hình chữ nhật cùngkích thước, hai điện cực nối với nguốn điện một chiều có hiệu điện thế cao [250400V], một volt kế hay một ampe kế cho phép đo hiệu điện thế và cường độ dòngđiện đi qua giấy.LysAspLeuM1ArgHisTyra]Hình II.4 - Điện di trên giấya] Thiết bò điện di b] Chuẩn bò giấy điện dib]+ Bước 1: chuẩn bò giấy điện diCắt một băng giấy điện di theo kích thước 3512cm. Vẽ một đường viếtchì ở giữa tờ giấy theo chiều ngang. Đònh vò các acid amin trên giấy.+ Bước 2: chấm dung dòch acid aminTiến hành chấm acid amin trên giấy như phần sắc ký [xem 3.12]Bước 3: tiến hành chạy điện diBÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI16Chương 3- Kỹ thuật điện diNhúng ướt giấy: kẹp một đầu và nhúng một đầu vào chậu dung dòch đệmsao cho mực nước còn cách lằn viết chì 1cm, đem ra thấm khô ngay giữa hai tờgiấy lọc và lặp lại như trên đối với nữa kia.Đem để băng giấy lên một tấm thuỷ tinh đã rửa sạch và khô. Làm ẩm đầuphần khô bằng mẫu giấy lọc thấm dung dòch đệm sao cho giấy đủ ướt để nhữngamino acid không bò lôi đi. Chồng tấm kính thứ hai lên. Chú ý là: hai đầu giấyphải nhúng vào dung dòch và bề mặt hai tấm kính cũng như băng giấy không đượcdính dấu vân tay. Đóng mạch điện.Dòng điện có hiệu điện thế cao nên kể từ đây không chạm vào bất cứ bộphận nào của máy. Cho máy chạy trong 1 giờ 15 phút, sau đó ngắt mạch điện.Bước 4: xác đònh acid amin bằng thuốc thửLấy tấm kính phía trên ra và sấy khô giấy bằng máy sấy. Quan sát các vệtacid amin hiện ra. Nhuộm băng giấy bằng thuốc thử ninhydrin, sau đó làm khôbằng máy sấy. Quan sát các vệt acid amin hiện ra và kết luận thành phần acidamin có trong hỗn hợp M1.Bước 5: Đònh lượng proteinXác đònh cường độ protein bằng cách đo cường độ màu của các vết.Cắt từng vết acid amin ra khỏi giấy sắc ký, cắt nhỏ giấy cho hết vào ốngnghiệm, rồi cho vào đó dung dòch CdCl2 48% trong ethanol hay 48% CuSO4 trongethanol, ngâm trong 3 giờ. Sau đó đem đo mật dộ quang trên máy soi màu ở bướcsóng 520nm. Xác đònh đường chuẩn acid amin [để biết nồng độ] dựa vào đườngchuẩn để xác đònh nồng độ acid amin có trong vết cắt.7 - Phát hiện vạch điện diSau khi phân tích bằng điện di các phân tử DNA trên gel người ta sử dụngmột số phương pháp làm hiện hình như sau:Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽgắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tửngoại. Điều này cho phép phát hiện các đoạn DNA trên gel.Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA được đánh dấu bằng đồng vòphóng xạ và vò trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi.Chúng còn có thể được đánh dấu bằng chất nhuộm chuyên biệt.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI17Chương 3- Kỹ thuật điện diHình II.5 – Phát hiện vạchđiện di bằng cách quan sátdưới tia tử ngoạiHình II.6 – Chụp ảnh trên gel document nhờ máy vitính8 - Phương pháp chụp hình gelGiới thiệuĐối với điện di DNA, người ta thường nhuộm ethidium bromide. Gel đượckhuêùch đại thông qua UV transilluminator. Với phương pháp này chúng ta cầnphim để chụp. Hiện nay với công nghệ thông tin hiện đại. Máy chụp được quamột hệ thống là gel document nhờ máy vi tính điều chỉnh thông qua phần mềmchuyên dụng. Với phương pháp này người ta in trực tiếp và lưu vào đóa.Phương phápHệ thống chụp được đặt trong phòng tối.1. Để gel trên UV transilluminator. Chú ý cẩn thận tránh tạo bọt khí. Tốtnhất là lấy giấy mềm thấm nước.2. Đặt phim vào trong máy chụp.3. Điều chỉnh máy chụp hình. Tập trung ảnh vào vò trí trung tâm và chỉnhhình cho rõ nét. Lúc này dùng hệ thống đèn sáng để chỉnh hình.4. Tắt hệ thống đèn, mở đèn UV, lúc này phải mang kính bảo hộ để tránhtia UV, ảnh hưởng đến mắt và da. Dùng tay nhẹ nhành di chuyển ốngkính để điều chỉnh hình cho sắc nét. Khi hình vào tiêu điểm, chỉnh hình.5. Bấm máy, tắt hệ thống đèn UV6. Cẩn thận rút phim ra khỏi máy. Đợi 45 phút, xong bỏ giấy bao trênhình.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI18Chương 3- Kỹ thuật điện diChú ý máy dễ bò dơ do phim chụp nhiều hoặc phim cũ, hệ thống càngbẩn chụp càng rất khó in hình. Do đó cần phải tháo kính ra lau chùi bằngcồn 70%.7. Sau khi chụp xong bỏ gel vào thùng chứa, lau sạch bàn.Chụp ảnh trên gel documentTrường hợp dùng hệ thống gel document, hình ảnh sẽ hiện ngay khi đặttrong buồng tối. Đặt gel vào trong buồng tối, điều chỉnh máy chụp hình.Có thể thông qua hệ thống vi tính điều chỉnh hình sắc nét trước khi chụpảnh. Thông qua hình ảnh lưu vào đóa lâu dài.9 - Thu nhận mẫu điện diĐối với điện di trên gel agarose còn được sử dụng để tinh sạch và thu nhậnmẫu. Nguyên tắc và điều kiện giống như điện di phân tích đã đề cập ở trên. Saukhi điện di các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhậnlại bằng một trong cách cách sau đây:+ Phương pháp 1: Phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA đượcthu nhận sau khi đã khuếch tán từ gel agarose vào trong một dung dòch đệm thíchhợp.+ Phương pháp 2: Một “giếng” nhỏ được khoét trong agarose ngay trướcvạch DNA. “Giếng” này được bơm đầy dung dòch đệm và điện trường được táilập. DNA di chuyển vào “giếng” chứa đầy dung dòch đệm và được thu nhận lại.+ Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trên một agarose gel đặc biệt cóđiểm nóng chảy rất thấp [65oC]. Sau khi điện di vạch DNA được cắt ra, ủ trongmột dung dòch đệm ở nhiệt độ 65oC. Sau khi agarose đã hoàn toàn nóng chảy,DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa.10 - Phân tích kết quả điện diDo việc phân tách sinh hoá kết quả điện di dựa trên điện tích, kích thước vàcấu tạo, điện di có thể cung cấp nhiều thông tin giá trò như độ tinh sạch và khốilượng phân tử. Độ tinh sạch được đánh giá thông qua số vạch trên băng điện di.Nếu chỉ có một vạch, nghóa là chỉ có một cấu tử hiện diện. Kết quả phân tích nàyđược đánh gía là tinh sạch. Nếu có hai hay nhiều vạch chúng tỏ mẫu có hai haynhiều cấu tử hiện diện, bò tạp nhiễm hay không tinh sạch và do đó ta gọi là dòhình hay không tinh sạch.Để kiểm tra về độ đồng nhất, người ta thường cho chạy một vệt chuẩn, từđó so sánh. Và thông thường để kiểm tra độ tinh sạch người ta kết hợp sử dụngphương pháp sắc ký khí hay sắc ký lỏng cao áp.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI19Chương 3- Kỹ thuật điện diCâu hỏi ôn tập1. Nêu nguyên tắc của phương pháp điện di.2. Những ưu điểm của phương pháp điện di trên gel polyacrylamid?3. Những thành phần tạo gel polyacrylamid?4. Nguyên tắc của phương pháp điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide [SDS - PAGE]?5. Trình bày phương pháp điện di trên gel agarose.6. Nguyên tắc của phương pháp điện di trên điện trường xung?7. Có những phương pháp nào phát hiện vạch điện di?8. Trình bày các phương pháp thu nhận mẫu điện di.BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI20