Sô tay hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích
|
8. ę` v` OF ......................................................................................................................... 7 6. ę` v` ęN pmg v MęFM ................................................................................................. 4 7. O` duoc cm` trêo C`y xèg omo féo c`hk MęFM ............................................................ 4 4. Tm` c`ho mkéo tr C`y xèg omo féo c`hk MęFM ........................................................... 4 5. Xuy Ęom bm` ęN/BM yêu gu `o n` f MęFM .................................................................... 4 @@@. F M WƩ PÊU GU FK M@L ...................................................................................... 5 Omoc gmoc t go tm`t trkoc F MW PGFM ........................................................... 5 8. MęFM gè omæo ..................................................................................................... 5 6. MęFM om÷l ......................................................................................................... 1 7. MęFM g÷ bmh` fèk Fêo tm 7 ............................................................................... 1 Lt s nƹu ü bm` Ę`o ęƨo PGFM ................................................................................ 3 8. Nƹu ü gmuoc ...................................................................................................................... 3 6. Nƹu ü gm` t`t bm` Ę`o ęƨo PGFM ..................................................................................... 3 7. L` quho m fk m`l ..................................................................................................... = Show
Thẩm định phương pháp phân tích là nhằm chứng minh qui trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng không. Thẩm định phương pháp phân tích là một khâu quan trọng, là cần thiết trong nghiên cứu phát triển thuốc mới. Trong bài viết này, Trung Tâm Thuốc Central Pharmacy (trungtamthuoc.com) xin gửi đến bạn đọc thông tin về thẩm định quy trình phân tích. 1 Thẩm định phương pháp phân tích là gì?1.1 Khái niệmThẩm định phương pháp phân tích là nhằm chứng minh qui trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng không. Thẩm định phương pháp phân tích là một khâu quan trọng, là cần thiết trong nghiên cứu phát triển thuốc mới, là dữ liệu bắt buộc phải có khi lập hồ sơ đăng ký thuốc, là bước khởi đầu cho các nghiên cứu liên quan tới nồng độ thuốc trong cơ thể như dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học,... của thuốc. Thẩm định phương pháp phân tích là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế. Các đặc điểm phân tích đặc trưng cần được thẩm định bao gồm: độ chọn lọc/ độ đặc hiệu, độ tuyến tính - đường chuẩn, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện, khoảng xác định. Đối với mẫu thử sinh học ngoài các chỉ tiêu trên, còn thẩm định các chỉ tiêu khác như giới hạn định lượng dưới; ảnh hưởng của nền mẫu (yêu cầu đối với phương pháp LC - MS); độ nhiễm chéo; tỷ lệ thu hồi; độ đúng, độ chính xác khi pha loãng mẫu; độ ổn định của dung dịch chuẩn, độ ổn định của mẫu sinh học ở những điều kiện bảo quản khác nhau. Tầm quan trọng của thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong nguyên liệu, thành phẩm và dịch sinh học đã được các nhà sản xuất dược phẩm nhận thức rõ ràng và đã được văn bản hóa trong nhiều hướng dẫn như ICH (International Conference on Harmonisation), EMA, US - FDA, ASEAN, ... Ở Việt Nam, năm 2018, trong Thông tư 32/2018/TT - BYT: Qui định việc đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc, Bộ Y tế đã có hướng dẫn chung về thẩm định phương pháp phân tích. Nội dung chương này trình bày thẩm định phương pháp phân tích bằng kỹ thuật sắc ký áp dụng đối với chất tổng hợp, không áp dụng với chế phẩm sinh học. Giới hạn chấp nhận của các chỉ tiêu thẩm định được đề xuất tuân thủ theo các hướng dẫn trên. Ngoài ra, các phụ lục 1 - 2 minh họa qui trình thẩm định chỉ tiêu định tính, định lượng, xác định tạp chất liên quan của thuốc thành phẩm bằng HPLC, phụ lục 3 trình bày ví dụ xác định mô hình đường chuẩn của qui trình thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng HPLC-UV. 1.2 Các loại qui trình phân tích cần thẩm địnhThẩm định qui trình phân tích liên quan đến 3 loại qui trình chung sau đây:
Tùy thuộc vào mục đích của qui trình phân tích mà yêu cầu các chỉ tiêu cần được đánh giá khác nhau. 1.3 Các chỉ tiêu thẩm định- Độ chọn lọc - độ đặc hiệu: Thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể xác định (định tính - định lượng) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các thành phần khác có trong mẫu. + Độ chọn lọc (selectivity) của một phương pháp phân tích là khả năng phân biệt các chất trong mẫu thử là hỗn hợp nhiều thành phần. + Độ đặc hiệu (specificity) của một phương pháp phân tích là khả năng xác định một cách chắc chắn sự có mặt chất phân tích khi có các thành phần khác. Tính đặc hiệu thường được xác định trong phép phân tích mà chỉ có một thông số đáp ứng như hoạt tính phóng xạ trong phép phân tích phóng xạ miễn dịch Khi xác định chất phân tích có mặt của chất có liên quan như chất phân hủy, chất chuyển hóa, tạp chất, tá dược thì thuật ngữ độ chọn lọc và độ đặc hiệu được dùng giống nhau. Tuy nhiên, tổ chức quốc tế có uy tín như IUPAC, AOAC ưu tiên dùng thuật ngữ “độ chọn lọc”, còn “độ đặc hiệu” dùng cho những phương pháp hoàn toàn có tính chọn lọc. Yêu cầu của thẩm định độ chọn lọc đối phép thử định tính là đánh giá sự có mặt của chất phân tích, phép thử định lượng là đảm bảo kết quả chính xác về hà lượng hay hoạt lực, còn định lượng tạp là phương pháp phân tích cho phép xác định chính xác hàm lượng tạp chất. - Đường chuẩn - khoảng tuyến tính: Biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của píc (diện tích hay tỷ lệ diện tích) và nồng độ thuốc. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ có mối tương quan tuyến tính với các đáp ứng phân tích. - Độ đúng (accuracy): Giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết. - Độ chính xác (precision): Là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại qui trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) hoặc hệ số biến sai CV (%) Độ chính xác có mức: + Độ lặp lại. (Repeatability): là độ chụm của kết quả khi lặp lại qui trình phân tích nhiều lần bởi một người phân tích, một thời điểm, cùng thiết bị, hóa chất. + Độ chính xác trung gian (Intermediate Precision) là độ chụm của kết quả khi lặp lại qui trình phân tích nhiều lần khi thay đổi các yếu tố ngẫu nhiên ảnh hưởng đến độ chính xác của qui trình phân tích. Đó là ngày phân tích, kiểm nghiệm viên, thiết bị,... Thực tế không cần phải nghiên cứu những ảnh hưởng này một cách riêng rẽ, mà có thể sử dụng thiết kế thực nghiệm tối ưu để đánh giá. + Độ tái lặp (Reproducibility): Độ tái lặp được xác định bằng cách so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm. Độ tái lập được tiến hành đánh giá trong trường hợp tiêu chuẩn hoá qui trình phân tích ví dụ như đối với các qui trình trong dược điển. - Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng + Giới hạn phát hiện (Limit of detection: LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không cần thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. + Giới hạn định lượng (Limit of quantitation: LOQ) là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận được. - Khoảng xác định là khoảng nồng độ có tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác chấp nhận được khi áp dụng để định lượng. - Độ thô (Robustness): khả năng duy trì của qui trình phân tích không bị ảnh hưởng bởi những biến đổi nhỏ nhưng có tính chủ định trong các thông số của phương pháp và chỉ ra mức tin cậy của qui trình trong điều kiện sử dụng bình thường. - Tỷ lệ thu hồi (của qui trình xử lý mẫu) là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo qui trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách, được pha trong nền mẫu đã được chiết. - Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong quá trình xử lý và bảo quản mẫu. Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử. - Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantitation: LLOQ) là nồng độ thấp nhất của đường chuẩn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác cho phép. - Ảnh hưởng của nền mẫu (Matrix Effect: ME) là ảnh hưởng của tất cả các thành phần khác ngoài chất phân tích có trong mẫu. 2 Thẩm định quy trình phân tích thuốc dạng nguyên liệu và thành phẩmCác chỉ tiêu cần phải thẩm định đối với qui trình phân tích thuốc dạng nguyên liệu và thành phẩm tùy thuộc vào chỉ tiêu chất lượng đánh giá (Bảng 5.1). Bảng 5.1. Các chỉ tiêu thẩm định phương pháp phân tích thuốc dạng nguyên liệu và thành phẩm Các chỉ tiêu Định tính Xác định tạp chất Định lượng: -Độ hòa tan -Hàm lượng/hoạt lực Định lượng Thử giới hạn Độ đúng - + - + Độ chính xác -Độ lặp lại -Độ chính xác trug gian - - + + (1) - - + + (1) -Độ chọn lọc đặc hiệu (2) + + + + Giới hạn phát hiện (LOD) - - (3) + - Giới hạn định lượng (LOQ) - + - - Tính tuyến tính - + - + Khoảng xác định - + - + Ghi chú: Dấu - : Không cần phải đánh giá Dấu +: Cần phải đánh giá (1): Trong trường hợp đã tiến hành kiểm tra độ tái lặp thì độ chính xác trung gian không cần phải xem xét (2): Một qui trình phân tích kém đặc hiệu có thể được bổ trợ bằng một hay nhiều qui trình phân tích hỗ trợ khác trong các (3): Có thể cần trong một số trường hợp. 2.1 Độ chọn lọcXác định độ chọn lọc yêu cầu được thực hiện khi thẩm định các phép thử định tính, xác định tạp chất và định lượng. Qui trình dùng để xác định độ chọn lọc phụ thuộc vào mục tiêu đã định của qui trình phân tích. 2.1.1 Đối với phép định tính, định lượngChuẩn bị các mẫu:
Đánh giá kết quả: - Thời gian lưu của píc chính trên sắc ký đồ dung dịch thử trùng với thời gian lưu píc chính dung dịch chuẩn - Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu placebo không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng píc thường yêu cầu phải không lớn hơn 1,0% so với đáp ứng píc của mẫu chuẩn. - Píc của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết. Hệ số chồng phổ UV của píc hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc ký đồ và phổ UV của píc tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn xấp xỉ 1,0. 2.1.2 Thử tạp chấtNhững tạp chất sẵn có Thêm vào mẫu thử một lượng thích hợp các tạp chất và chứng minh rằng từng tạp chất riêng biệt này được tách riêng rẽ ra khỏi nhau và/hoặc ra khỏi các thành phần khác có trong mẫu. Những tạp chất không có sẵn So sánh kết quả phân tích của mẫu thử có chứa tạp chất hoặc các sản phẩm phân huỷ bằng qui trình phân tích đã xây dựng với qui trình chính thống khác. Có thể so sánh với kết quả của mẫu được xử lý ở các điều kiện khắc nghiệt như: ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, acid, kiềm, chất oxi hoá, chất khử. Ví dụ: Thử tạp chất có sẵn Chuẩn bị mẫu chuẩn và tạp. Sắc ký lần lượt mẫu trắng - > mẫu chuẩn -> mẫu tạp - > mẫu chuẩn thêm tạp. Đánh giá kết quả: Xác định độ phân giải Rs giữa 2 píc liền kề, thông thường yêu cầu Rs ít nhất không được nhỏ hơn 1,5. Ví dụ cụ thể về đánh giá ảnh hưởng của các tác nhận đẩy nhanh quá trình phân hủy khi bảo quản được trình bày trong Phụ lục 2. Trong một số trường hợp đánh giá tỷ lệ đỉnh - hõm (p/v). Giá trị này phải nằm trong giới hạn qui định đối với mỗi trường hợp cụ thể. 2.2 Khoảng tuyến tínhThực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc hoặc cân riêng biệt chuẩn để pha ứng với mỗi điểm nồng độ. Chuẩn bị ít nhất 5 dung dịch chuẩn, có nồng độ tùy thuộc qui trình thẩm định. Trong các nghiên cứu thẩm định phương pháp định lượng, khoảng nồng độ thường lựa chọn từ 50 - 150% của nồng độ thử đối với mỗi qui trình Đối với phương pháp định lượng tạp chất tiến hành cùng với định lượng hàm 100% của định lượng lượng tạp chất tiến 100% của định lượng dược chất) hoặc đánh giá bằng tích thì khoảng nồng độ phải từ LOQ hoặc giới hạn báo cáo/bỏ qua (Reporting/disregard limit) đến 120% của chuẩn định lượng dược chất. Trong đó, nồng độ tại LOQ phải nhỏ hơn giới hạn báo cáo/bỏ qua. Đánh giá kết quả - Qui trình định lượng: Hệ số tương quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,998 và % hệ số chắn tại nồng độ 100% phải không lớn hơn 2,0%. - Qui trình thử độ hòa tan: Nếu thiết kế thẩm định như 1 qui trình định lượng thì giới hạn như phép định lượng. Còn nếu thiết kế có tính đến yếu tố đặc tính của phép thử (thử trên thiết bị thử độ hòa tan hoặc dung dịch chuẩn được pha trong nền mẫu,...) thì hệ số tương quan tuyến tính (r) phải không nhỏ hơn 0,995; % hệ số chẵn tại nồng độ 100% phải không lớn hơn 3,0%. - Qui trình định lượng tạp chất: Hệ số tương quan tuyến tính (r) phải không nhỏ hơn 0,99; % hệ số chắn tại nồng độ giới hạn phải không lớn hơn 10,0%. Trường hợp nằm ngoài khoảng qui định, phải có sự giải thích phù hợp. 2.3 Độ đúngĐộ đúng cần được thiết lập trong khoảng xác định của qui trình phân tích. 2.3.1 Định lượng2.3.1.1 Nguyên liệuThực hiện đối với chất phân tích đã biết rõ độ tinh khiết (ví dụ chất đối chiếu). 2.3.1.2 Thành phẩm thuốcCó thể xác định bằng một trong các phương pháp sau: - Phương pháp mẫu tự tạo: Thêm một lượng đã biết chất đối chiếu vào hỗn hợp nền mẫu tự tạo chứa các thành phần của thành phẩm thuốc nhưng không có dược chất. - Phương pháp thêm chuẩn: Trong trường hợp không có đầy đủ các thành phần để làm mẫu tự tạo thì có thể chấp nhận cho thêm một lượng đã biết của chất cần phân tích vào chế phẩm. 2.3.1.3 Chuẩn bị mẫuĐối với mỗi qui trình phân tích, khi thẩm định độ đúng thường chuẩn bị ở 3 mức nồng độ: - Định lượng: 80%, 100%, 120% của nồng độ thử - Độ đồng đều hàm lượng: 70%, 100% và 130% nồng độ thủ trừ trường hợp do bản chất của dạng bào chế thì cần khoảng nồng độ rộng hơn. -Thử độ hoà tan: nhỏ hơn 20% mức giới hạn độ hòa tan trong tiêu chuẩn chất lượng, 100% và 120% so với nhãn. 2.3.1.4 Định lượngXác định hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu thẩm định bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn được chuẩn bị theo chỉ dẫn trong qui trình phân tích hoặc phương trình hồi quy tuyến tính được tiến hành song song. 2.3.1.5 Đánh giá kết quảXác định độ đúng (Tỷ lệ thu hồi) theo công thức: Độ đúng (%) = (Lượng hoạt chất tìm lại / Lượng hoạt chất thêm vào) × 100% - Định lượng: Tỷ lệ thu hồi 98 - 102% ở mỗi mức nồng độ, RSD không lớn hơn 2,0% ở mỗi mức nồng độ. - Thử độ hòa tan: Nếu thiết kế thẩm định như 1 qui trình định lượng thì giới hạn như phép định lượng. Còn nếu thiết kế có tính đến yếu tố đặc tính của phép thử thì tỷ lệ thu hồi cho phép 95 - 105% ở mỗi mức nồng độ, RSD không lớn hơn 5,0% ở mỗi mức nồng độ. Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp. 2.3.2 Tạp chất (định lượng)Độ đúng phải được tiến hành trên các mẫu thử (nguyên liệu hoặc thành phẩm thuốc) đã được thêm một lượng tạp chuẩn đã biết. Trong trường hợp không có tạp và/hoặc sản phẩm phân huỷ chuẩn thì có thể chấp nhận so sánh kết quả thu được với một qui trình độc lập. Hệ số đáp ứng của hoạt chất cũng có thể được sử dụng. 2.3.2.1 Chuẩn bị mẫuTùy từng quy trình, chuẩn bị mẫu có khoảng nồng độ khác nhau, nhưng phải đảm bảo khoảng xác định phủ được nồng độ tạp ở mức phải báo cáo đến 120% nồng độ tạp ở mức giới hạn theo tiêu chuẩn. 2.3.2.2 Định lượngXác định hàm lượng tạp chất có trong các mẫu thẩm định bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn được chuẩn bị theo chỉ dẫn trong qui trình phân tích hoặc phương trình hồi quy tuyến tính được tiến hành song song. 2.3.2.3 Đánh giá kết quả- Nếu thiết kế thẩm định qui trình xác định tạp chất xung quanh mức giới hạn (± 20%) thì tỷ lệ thu hồi 90 - 110% và RSD không lớn hơn 10,0% ở mỗi mức nồng độ. - Nếu xác định tạp chất tiến hành cùng với định lượng hàm lượng dược chất thì qui định về tỷ lệ thu hồi và RSD tùy thuộc nồng độ chất phân tích có thể tham khảo giới hạn chấp nhận theo AOAC (Bảng 5.2). Thông thường cho phép tỷ lệ thu hồi 90 - 110% và RSD ≤ 10,0% ở mỗi mức nồng độ. Riêng mức LOQ tỷ lệ thu hồi cho phép từ 85 - 115% và RSD không lớn hơn 15,0%. Trường hợp nằm ngoài khoảng qui định, phải có sự giải thích phù hợp. Bảng 5.2. Độ thu hồi chấp nhận, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD), độ lệch chuẩn tương đối tái lặp (RSDR) ở các nồng độ khác nhau TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi RSDr (%) RSDR (%) 1 100 1 100 % 98-101 1 2 2 ≥ 10 10-1 10 % 95-102 1,5 3 3 ≥ 1 10-2 1 % 92-105 2 4 4 ≥ 0,1 10-3 0,1 % 90-108 3 6 5 0,01 10-4 100 ppm 85-110 4 8 6 0,001 10-5 10 ppm 80-115 6 12 7 0,0001 10-6 1 ppm 75-120 8 16 8 0,000001 10-8 10 ppb 70-125 15 32 2.4 Độ chính xácĐộ chính xác được thực hiện trên mẫu thử hoặc mẫu tự tạo. Ưu tiên sử dụng đối tượng thẩm định là thuốc thành phẩm. 2.4.1 Độ lặp lại. (Repeatability)2.4.1.1 Chuẩn bị mẫuCó thể thực hiện theo 1 trong 2 cách sau: - Thực hiện lặp lại qui trình phân tích tối thiểu 9 lần ở 3 mức nồng độ tương tự như xác định độ đúng bằng phương pháp mẫu tự tạo. - Thực hiện lặp lại qui trình phân tích tối thiểu 6 lần ở mức nồng độ 100%. 2.4.1.2 Định lượngXác định hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu thẩm định bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn được chuẩn bị theo chỉ dẫn trong qui trình phân tích hoặc phương trình hồi quy tuyến tính được tiến hành song song 2.4.1.3 Đánh giá kết quả- Định lượng: RSD không lớn hơn 2,0% ở mỗi mức nồng độ. - Thử độ hòa tan: Nếu thiết kế thẩm định như 1 qui trình định lượng thì giới hạn như phép định lượng. Còn nếu thiết kế có tính đến yếu tố đặc tính của phép thử thì RSD không lớn hơn 5,0% ở mỗi mức nồng độ - Định lượng tạp chất: + Nếu thiết kế thẩm định xung quanh mức giới hạn (± 20%) thì RSD phải không lớn hơn 10,0% ở mỗi mức nồng độ. + Nếu tạp được xác định cùng với qui trình định lượng thì qui định về RSD tùy thuộc nồng độ chất phân tích theo qui định của AOAC (Bảng 5.2). Thông thường cho phép RSD không lớn hơn 10,0% ở mỗi mức nồng độ, riêng mức LOQ không lớn hơn 15%. Trường hợp nằm ngoài khoảng qui định, phải có sự giải thích phù hợp. 2.4.2 Độ chính xác trung gianThực hiện tương tự như đối với độ lặp lại nhưng thay đổi điều kiện phân tích như người phân tích khác, ngày phân tích, thiết bị,... Gộp kết quả thẩm định của 2 lô số liệu. Đánh giá kết quả:
Trường hợp nằm ngoài khoảng qui định, phải có sự giải thích phù hợp. Khi thực hiện thẩm định độ chính xác chỉ tiêu độ hòa tan hoặc độ đồng đều hàm lượng của thuốc thành phẩm cần loại yếu tố ảnh hưởng tới độ chụm từ mẫu thử bằng cách lựa chọn các đơn vị mẫu có khối lượng lệch nhau không quá 2% (đơn vị bé nhất và đơn vị lớn nhất) trong qui trình thẩm định dùng mẫu chế phẩm. 2.5 Khoảng xác địnhKhoảng xác định là khoảng nồng độ đáp ứng yêu cầu về tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác và được áp dụng để định lượng mẫu thử chứa chất phân tích với hàm lượng nằm trong khoảng nồng độ đó. 2.6 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượngCó thể xác định LOD và LOQ bằng một trong các phương pháp sau: 2.6.1 Dựa vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễuChuẩn bị dung dịch mẫu thử từ mẫu thử đã biết nồng độ hoặc bằng cách thêm chuẩn vào nền mẫu placebo ở mức độ thấp. Xác định tỉ lệ đáp ứng (S) trên nhiễu (N) của đáp ứng đo được trên mẫu thử với đáp ứng của mẫu trắng, từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được hoặc định lượng được.
2.6.2 Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc
Trong đó:
Độ dốc S có thể được tính dựa vào đường chuẩn của chất phân tích. Có thể xác định ꝍ theo nhiều cách khác nhau, như: - Dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng: Tiến hành lặp lại một số lượng thích hợp phép phân tích trên mẫu trắng (thường là 10 lần, tối thiểu 6 lần), đo đáp ứng nền và tính độ lệch chuẩn của các đáp ứng này. - Dựa vào đường chuẩn: Dựa vào đường chuẩn đặc trưng của mẫu thử có chứa chất phân tích có nồng độ nằm trong khoảng giới hạn phát hiện. Số dư độ lệch chuẩn của đường hồi quy hoặc độ lệch chuẩn của giá trị giao điểm với trục tung của đường hồi quy có thể được sử dụng như là độ lệch chuẩn. 2.6.3 Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và giá trị trung bìnhDựa vào độ lệch chuẩn khi phân tích trên nền mẫu tự tạo. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử bằng cách thêm chuẩn vào nền mẫu placebo ở mức nồng độ thấp. Làm lặp lại tối thiểu 10 lần. 2.6.3.1 Tính toán kết quảTính giá trị trung bình x và độ lệch chuẩn SD của đáp ứng phân tích (diện tích píc). LOD = 3 × SD LOQ = 10 × SD Yêu cầu: 4 ≤ R ≤ 10 với R = x /LOD. 2.7 Độ thô (Robustness)Đánh giá độ thô cần được xem xét trong giai đoạn phát triển phương pháp và tuỳ thuộc vào loại qui trình phân tích đang nghiên cứu. Độ thô chỉ ra được mức độ tin cậy của phương pháp khi có những thay đổi nhỏ có chủ định của các thông số của phương pháp. Nếu những phép đo nhạy cảm với những thay đổi điều kiện phân tích, thì điều kiện phân tích cần được kiểm soát thích hợp hoặc chỉ dẫn những điểm cần lưu ý trong quá trình phân tích. Kết quả đánh giá độ thô là kết quả đánh giá dãy các thông số phản ánh tính thích hợp của hệ thống (ví dụ phép thử độ phân giải) phải được thiết lập để đảm bảo duy trì được tính hiệu lực của qui trình phân tích bất kỳ khi nào sử dụng. Những biến đổi thường gặp trong phân tích là tính ổn định của các dung dịch phân tích, thời gian chiết, ảnh hưởng của điều kiện sắc ký. Đối với HPLC là sự thay đổi pH pha động, thành phần trong pha động, cột tách khác nhau (do nhà cung cấp và /hoặc lô khác nhau), chương trình nhiệt tốc độ dòng khí. 2.8 Phép thử tính thích hợp của hệ thốngKiểm tra tính tương thích hệ thống là một phần không thể tách rời trong qui trình phân tích. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống là những phép thử thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử. Các thông số của phép thử tính tương thích của hệ thống được thiết lập cho từng qui trình riêng biệt phụ thuộc vào loại qui trình được thẩm định, thành phần mẫu thử đơn hoặc đa thành phần,... Đối với qui trình định lượng thông số bắt buộc đánh giá là giá trị RSD của đáp ứng phân tích để tính kết quả (diện tích píc) phải không lớn hơn 2,0% nếu không có yêu cầu riêng. Ngoài ra, các thông số khác có thể yêu cầu số đĩa lý thuyết, độ phân giải, độ cân xứng píc, ... Còn đối với qui trình xác định tạp chất, thông số độ nhạy hay được yêu cầu đánh giá ngoài các thông số khác. 2.9 Tái thẩm định phương phápPhương pháp phải tái thẩm định khi có sự thay đổi trong khâu tổng hợp nguyên liệu dược chất, thay đổi thành phần của thành phẩm hoặc thay đổi qui trình phân tích. Mức độ thẩm định lại tuỳ thuộc vào bản chất của sự thay đổi 3 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học3.1 Các mức độ thẩm định phương pháp phân tích sinh họcĐối với thẩm định phương pháp phân tích sinh học được chia ra ba mức độ như sau: 3.1.1 Thẩm định đầy đủ (full validation)Thẩm định đầy đủ rất quan trọng khi: - Xây dựng và triển khai phương pháp phân tích sinh học lần đầu. - Đối với thuốc mới. - Đối với phương pháp định lượng đã phê chuẩn, nếu có mặt sản phẩm chuyển hóa của chất cần phân tích. 3.1.2 Thẩm định một phần (partial validation)Thẩm định một phần được sử dụng khi có những thay đổi trong phương pháp phân tích sinh học đã được thẩm định. Khi tiến hành, có thể chỉ cần xác định lại độ đúng, độ chính xác hoặc phải làm lại hầu hết các tiêu chí trong thẩm định đầy đủ. Phải các tiêu chí tiến hành thẩm định một phần phương pháp phân tích trong các trường hợp sau:
3.1.3 Thẩm định chéo (cross validation)Thẩm định chéo là so sánh các thông số thẩm định khi hai hay nhiều phương pháp phân tích được sử dụng để cung cấp dữ liệu cho cùng một nghiên cứu hoặc cho các nghiên cứu khác. Phương pháp dùng làm đối chiếu hay dùng là phương pháp phân tích sinh học gốc đã được thẩm định. Thẩm định chéo thường được tiến hành để xác lập độ tin cậy giữa các phòng thí nghiệm với nhau khi tiến hành phân tích mẫu trong cùng một nghiên cứu được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm khác nhau. Thẩm định chéo cũng được xem xét khi các dữ liệu thu được từ nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau. 3.2 Các loại mẫu thử trong thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học- Mẫu trắng (mẫu blank): là dịch sinh học trắng không chứa chất phân tích và/ hoặc chất chuẩn nội. - Mẫu zero: là mẫu chuẩn bị bằng cách pha chuẩn nội (IS) trong dịch sinh học trắng. - Mẫu đường chuẩn (Mẫu CC): là mẫu chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích ở các nồng độ xác định khoảng tuyến tính và chuẩn nội trong dịch sinh học trắng. - Nền mẫu: mẫu dịch sinh học trắng được chiết tách loại tạp theo qui trình. - Mẫu chuẩn kiểm tra (Quality Control: QC): là những mẫu tự tạo biết trước nồng độ, chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích trong mẫu sinh học trắng. - Mẫu giới hạn định lượng dưới: Mẫu chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích trong mẫu sinh học trắng ở nồng độ thấp nhất dự kiến. Giá trị nồng độ LLOQ dự kiến tùy thuộc phạm vi ứng dụng của phương pháp, nếu qui trình phân tích sử dụng để đánh giá tương đương sinh học thì LLOQ lựa chọn nhỏ hơn hoặc bằng 1/20 – 1/30 nồng độ hấp thu cực đại của thuốc. - Mẫu ULOQ: Mẫu có nồng độ cao nhất của đường chuẩn vẫn đảm bảo tính tuyến tính và píc chất phân tích sắc nét, không bị biến dạng. Giá trị nồng độ ULOQ dự kiến tùy thuộc phạm vi ứng dụng của phương pháp, thông thường ULOQ sẽ lớn gấp 100 - 500 lần LLOQ; - Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (LQC: Low Quality Control): Mẫu có nồng độ thấp của đường chuẩn được chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích trong mẫu sinh học trắng ở nồng độ lớn gấp 2 - 3 lần LLOQ; - Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (MQC: Medium Quality Control): Mẫu có nồng độ trung bình của đường chuẩn được chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích trong mẫu sinh học trắng ở nồng độ trong khoảng 40 - 60% ULOQ; - Mẫu kiểm tra nồng độ cao (HQC: High Quality Control): Mẫu có nồng độ cao của đường chuẩn được chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích trong mẫu sinh học trắng ở nồng độ trong khoảng 70 - 90% ULOQ; - Mẫu kiểm tra pha loãng (DC: Diluted control): Mẫu có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn, được chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích trong mẫu sinh học trắng ở nồng độ cao gấp 2 - 3 lần nồng độ HỌC, sau đó pha loãng tiếp bằng huyết tương trắng với độ pha loãng theo dự kiến. Các mẫu tự tạo dùng trong thẩm định phương pháp phân tích có thể được chuẩn bị bằng cách thêm một thể tích nhỏ dung dịch chuẩn vào mẫu sinh học (yêu cầu thể tích thêm vào phải dưới 5% thể tích của mẫu thử để không làm ảnh hưởng đến bản chất mẫu sinh học) hoặc cô khô dung dịch chuẩn dưới luồng khí nitơ và nhiệt độ khoảng 40°C, sau đó hòa tan cắn chất phân tích trong dịch sinh học sử dụng. 3.3 Thực hiện thẩm định phương pháp thuốc trong dịch sinh học3.3.1 Độ chọn lọc - độ đặc hiệuChuẩn bị các mẫu như sau:
3.3.1.1 Đánh giá kết quả- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng píc của từng mẫu trắng và mẫu zero phải không được lớn hơn 20% đáp ứng píc của mẫu LLOQ tương ứng; - Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng píc của từng mẫu trắng phải không lớn hơn 5% đáp ứng trung bình của mẫu CC, QC và LLOQ. Trong thực nghiệm, phép thẩm định chỉ tiêu độ chọn lọc thường được tiến hành song song cùng chỉ tiêu độ đúng để giảm thiểu số mẫu thực nghiệm. 3.3.2 Độ nhiễm chéo- Chuẩn bị 6 mẫu dịch sinh học trắng, 6 mẫu chứa IS và chất phân tích có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (LLOQ) và ít nhất 1 mẫu chứa IS và chất phân tích có nồng độ cao nhất trên đường chuẩn (ULOQ). - Tiến hành xử lý các mẫu trên qui trình - Tiêm mẫu LLOQ trước, sau đó tiêm xen kẽ từng mẫu trắng sau khi tiêm mẫu ULOQ. Xác định đáp ứng píc của mẫu trắng và mẫu LLOQ 3.3.2.1 Tiêu chuẩn chấp nhận- Tại thời điểm trùng thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng píc trung bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng píc của từng mẫu trắng; - Tại thời điểm trùng thời gian lưu của IS, đáp ứng píc trung bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng píc của từng mẫu trắng. 3.3.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính- Tiến hành trên ít nhất 5 đường chuẩn, đường chuẩn bao gồm ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một loại mẫu dịch sinh học. Chuẩn bị các mẫu tự tạo theo quy trình. - Xác định hệ số trọng số (weighting): + Xác định mức độ biến thiên (variance) đáp ứng ở 2 nồng độ LLOQ và ULOQ; + Tính Fthực nghiệm theo công thức: Fthực nghiệm = Phương sai của ULOQ/Phương sai của LLOQ. + Xác định giá trị Fbảng bằng cách tra bảng F - distribution table với a = 0,01; df1 = n - 1; df2 = n - 1, n là số đường chuẩn thực nghiệm. + Nếu Fthực nghiệm < F - bảng → Không sử dụng hệ số trọng số. Nếu Fthực nghiệm > F - bảng chứng tỏ tập hợp kết quả không đồng nhất → Cần sử dụng hệ số trọng số. + Khảo sát các hệ số trọng số: 1, 1/x, 1/x2, 1/x1/2. Xác định phương trình hồi qui tuyến tính theo công thức: + Đối với mỗi mô hình trọng số, tính % tìm lại ở mỗi điểm chuẩn, tính sai số dư bằng % tìm lại trừ đi 100% tính tổng sai số dư (Sum % RE) bằng tổng giá trị tuyệt đối của các giá trị sai số dư. Thực hiện bước này cho từng đường chuẩn đã xây dựng. + Lựa chọn mô hình nào có tổng sai số dư (Sum % RE) của các đường chuẩn thực nghiệm nhỏ nhất và trên đồ thị phần dư của mô hình đó, dữ liệu thực nghiệm phân bố đều nhất xung quanh trục nồng độ. - Tính lại nồng độ mỗi điểm chuẩn theo phương trình hồi quy đã xây dựng được, xác định độ đúng so với giá trị thực của từng nồng độ. 3.3.3.1 Tiêu chuẩn chấp nhận- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ đều đạt từ 85 - 115%,trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80% - 120%. Thẩm định phương pháp phân tích là gì?Thẩm định phương pháp phân tích là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế. Tại sao phải thẩm định quy trình phân tích?Việc thẩm định quy trình phân tích là nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng không. Tại sao phải thực hiện thẩm định quy trình sản xuất?Thẩm định quy trình sản xuất là biện pháp để đảm bảo rằng các quy trình sản xuất có đủ khả năng tạo ra các sản phẩm có chất lượng đạt yêu cầu một cách ổn định. Thẩm định quy trình sản xuất bao gồm việc cung cấp bằng chứng dưới dạng văn bản về tính ổn định và lặp lại của các bước trọng yếu của quy trình sản xuất. Phương pháp thụ tinh khiết là gì?+ Thử tinh khiết là để khẳng định tất cả các quy trình phân tích cho phép xác định chính xác hàm lượng tạp chất trong chất phân tích ví dụ như phép thử tạp chất liên quan, kim loại nặng, hàm lượng của dung môi tồn dư ... |
