xét nghiệm hpv genotype real-time pcr là gì

I. MỤC ĐÍCH

Quy định thống nhất các bước tiến hành realtime PCR định tính và lai DNA định genotype HPV.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

VI. NGUYÊN LÝ

Virus u nhú người [human papilloma virus HPV] gây những tổn thương tăng sinh của biểu mô vảy bao gồm u nhú [mụn cơm] thông thường, u nhu phẳng, u nhú gan bàn chân, u nhú hậu môn sinh dục, bệnh u nhú thanh quản. Nhiễm HP cũng góp phần vào sự phát sinh loạn sản biểu mô vảy và ung thư biểu mô vảy sinh dục.

HPV là những virus DNA kép, chúng là thành phần của nhóm papovavirus. Trên 60 type khác nhau của hPV đã được xác định và những type khác nhau kết hợp với những tổn thương khác nhau. Những type 1,2 và 4 của HPV gây u nhú thông thường và u nhú gan bàn chân. Những u nhú 6,10,11 và 40 đến 45 gây u nhú hậu môn sinh dục. Những type 16,28.31 kết hợp với ung thư biểu mô vảy đường sinh dục.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R [Eppendorf]

- Máy ly tâm MF 80 [ Hanil]

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu [-20°C]

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA RNA tự động SaMag 12 Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm

- Tube đựng bệnh phẩm 15ml, 50ml

- Đầu côn có lọc 10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm

- Giấy xét nghiệm

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm

- Bút viết kính

- Bút bi

- Mũ

- Khẩu trang

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ

- Quần áo bảo hộ

- Dung dịch nước rửa tay

- Cồn sát trùng tay nhanh

- Dung dịch khử trùng

- Khăn lau tay

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

7.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VIII. NỘI DUNG

8.1. Quy trình tách chiết DNA

8.1.1. Chuẩn bị

- Khởi động tủ an toàn sinh học, máy tách chiết DNA RNA tự động ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

- Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học

- Đánh số thứ tự các mẫu bệnh phẩm;

- Ghi nhãn, dán và đánh dấu lên ống effendorf loại 1,5 ml để đựng BP

- Đối với BP là dịch được quyệt bằng tăm bông vô trùng: Bẻ đầu tăm bông chứa BP vào ống effendorf 1,5ml, bổ sung 500 µl dung dịch TE 1X, sau đó vortex đều.

- Đối với BP là mảnh sinh thiết hoặc vẩy da: Cho BP vào ống effendorf, bổ sung dung dịch TE 1X, dùng chày vô trùng nghiền nhỏ, sau đó bổ sung thêm dung dịch TE 1X cho đủ 500 µl, rồi tiến hành vortex.

8.1.2. Quy trình tách chiết DNA bằng hệ thống tự động

1. Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

2. Hút 10µl RNA carier vào ống đựng bệnh phẩm

4. Cho 200µl BP vào ống có chứa hỗn hợp RNA carier và IC

5. Chọn protocol barcode

6. Chọn Sample volume

7. Chọn elution tube type và elution volume

8. Chọn Run để tiến hành tách chiết DNA

9. DNA sau khi được tách chiết phải được bảo quản ở tủ đá có nhiệt độ -200 C

8.3. Quy trình RT PCR định tính HPV

8.3.1. Khởi động máy và khai báo chương trình PCR

Bước 1: Khởi động máy

- Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu xanh là báo hiệu khởi động máy thành công.

- Bật máy tính và mở chương trình phần mềm

- Kiểm tra kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR: nút play màu xanh là kết nối thành công

Bước 2: Khai báo trên PCR plate

- Xác định vị trí đặt ống PCR

- Chọn unknown cho mẫu BP, chứng âm và chứng dương, khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu.

- Lựa chọn màu FAM + HEX cho mẫu BP, chứng dương và chứng âm. Trong đó, FAM phát hiện HPV và HEX phát hiện chứng nội tại.

- Khai báo các thông số khác: Thể tích chạy mẫu là 25µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và dạng ống PCR - 0.2 ml corning tube.

Bước 3: Cài đặt chương trình luân nhiệt và tích vào ô pulse

8.3.2. Real-time PCR xác định HPV

Bước 1: Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0.2 ml đặt trên các giá lạnh

Bước 2: Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR: viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết lên nắp, vì máy chụp hình từ trên nắp ống.

Bước 3: Ly tâm ống PCR chứa hỗn hợp master mix

Bước 4: Hút 5 µl chứng dương, chứng âm và dung dịch DNA mẫu BP vào các tube tương ứng. Thao tác mẫu nào, chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng thật chặt nắp tube ngay để tránh lây nhiễm.

Bước 5: Ly tâm các ống PCR để dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 6: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra tình trạng tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.

Bước 7: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

- Chọn chứng [+] và chứng [-] và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng [-] không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng [+] và mẫu BP.

- Kết quả chứng [-] có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

- Chọn chứng [+] và chứng [-] và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng [-] có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.

- Kết quả chứng [-] không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Kiểm tra độ nhạy của master mix

- Chọn chứng [+] và chứng [-] và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Đọc kết quả Ct của chứng [+], số copy 100 - Ct = 30 -