Ưu điểm nổi bật của mô hình Watson Crick là cho phép dự đoán ngay được cơ chế tái bản của DNA. Ngay sau khi mô hình cấu trúc DNA được nêu ra, nhiều thí nghiệm được tiến hành để xác nhận các dự đoán.
Nội dung chính Show
- Sự tái bản DNA theo cơ chế bán bảo tồn [semi-conservative mechanism]
- Cơ chế phân tử của quá trình tái bản DNA
- Đơn vị tái bản, điểm khởi đầu và điểm kết thúc tái bản
- Điểm khởi đầu tái bản và giai đoạn khởi đầu:
- Chạc ba tái bản và hệ thống các enzim tái bản
- Tái bản ở đoạn cuối nhiễm sắc thể [telomere replication]:
- Video liên quan
Trong chuỗi xoắn kép DNA, hai mạch đơn liên kết với nhau bằng một quan hệ bổ sung. Như vậy, trong quá trình tái bản, nếu hai mạch đơn tách rời nhau và mỗi mạch đơn được dùng làm khuôn để tổng hợp nên một mạch mới theo nguyên tắc bổ sung thì kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu đã tạo ra được hai phân tử mới giống hệt nhau. Vì trong mỗi phân tử DNA con đều mang một mạch cũ và một mạch mới nên kiểu tái bản này được gọi là bán bảo tồn.
Cơ chế bán bảo tồn đã được Meselson và Stahl chứng minh bằng thực nghiệm vào năm 1958. Người ta nuôi E.coli trong môi trường có nguồn N15, tế bào sẽ sử dụng N15 để tổng hợp DNA cho đến khi tất cả DNA của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N15. Sau đó các tế bào được chuyển sang môi trường có chứa N14. Cách khoảng thời gian đều đặn tương ứng với mỗi đợt phân bào, người ta lấy các tế bào đem chiết tách DNA. Bằng phương pháp ly tâm trong gradient tỉ trọng CsCl, các loại DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra, kết quả phân tích phù hợp với kiểu tái bản bán bảo tồn.
Cơ chế phân tử của quá trình tái bản DNA
Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm ra cơ chế phân tử của quá trình tái bản. Đó là một quá trình phức tạp có sự khác biệt ở prokaryote và eukaryote nhưng phải trải qua cơ chế chung sau:
- Các liên kết hydrogen ổn định cấu trúc xoắn và liên kết hai mạch đơn với nhau phải được phá vỡ để tách rời hai mạch.
- Phải có đoạn mồi [primer], tức là đoạn DNA/RNA ngắn, bắt cặp bổ sung với mạch khuôn để tạo đầu 3OH tự do.
- Nguyên liệu tổng hợp DNA là các desoxynucleosid 5-triphosphate [dNTPs]: dATP, dGTP, dCTP và TTP.
- Mạch khuôn luôn được đọc theo chiều 3-5 trong khi mạch mới được tổng hợp theo chiều 5-3. Mỗi nucleotide mới được gắn vào đầu 3OH của mạch đang kéo dài bằng liên kết cộng hoá trị. Năng lượng cho sự polymer hoá đến từ việc thủy phân các dNTPs, loại ra các pyrophosphate.
- Mỗi bước được thực hiện một cách nhanh chóng, chính xác dưới sự điều khiển của enzyme đặc hiệu.
Đơn vị tái bản, điểm khởi đầu và điểm kết thúc tái bản
Mỗi đoạn DNA được tái bản như là một đơn vị riêng lẻ được gọi là một đơn vị tái bản [replicon]. Các DNA dạng vòng, kích thước nhỏ [chẳng hạn như nhiễm sắc thể của vi khuẩn và DNA virus] chỉ gồm một đơn vị tái bản duy nhất. Sự tái bản khởi đầu từ một điểm gọi là điểm khởi đầu sao chép [origin] và lan ra theo hai hướng, hình thành hai chạc ba tái bản [replication fork] cho đến khi gặp nhau tại điểm kết thúc [terminus]. Điểm khởi đầu tái bản có khuynh hướng giàu A-T để dễ dàng khởi đầu tách rời hai mạch đơn.
Ở eukaryote, mỗi phân tử DNA bao gồm nhiều đơn vị tái bản. Mỗi đơn vị tái bản có điểm khởi đầu riêng và sự tái bản cũng lan ra theo hai hướng. Khi các chạc ba tái bản gặp nhau thì sự tái bản DNA được hoàn thành. Ví dụ như tế bào hữu nhũ điển hình có từ 50.000 100.000 đơn vị tái bản, mỗi đơn vị tái bản có kích thước khoảng 40 200 kb.
1.4 Sự tổng hợp mạch mới của DNA xảy ra liên tục trên một mạch và gián đoạntrên mạch kia[Semi-discontinuous replication - Tái bản bán gián đoạn]
Trong tái bản bán bảo tồn, cả hai mạch mới của DNA được tổng hợp đồng thời ở mỗi chạc ba tái bản. Tuy nhiên, cơ chế tái bản DNA chỉ cho phép sự tổng hợp theo hướng 5 3, vì thế trên hai mạch khuôn có hướng ngược nhau, sự tổng hợp mạch mới không diễn tiến giống nhau.
- Từ điểm khởi đầu tái bản, trên mạch khuôn 3- 5 sự tổng hợp mạch mới diễn ra một cách liên tục theo chiều 5- 3 cùng chiều với hướng tháo xoắn. Mạch này được gọi là mạch tới [leading strand].
- Trong khi đó trên mạch khuôn 5 3, sự tổng hợp mạch mới cũng diễn ra theo hướng 5 3 nhưng ngược với hướng tháo xoắn. Chính vì thế, sự tổng hợp mạch mới không xảy ra liên tục mà dưới dạng những đoạn ngắn được gọi là đoạn Okazaki [kích thước 1000 2000 bp ở prokaryote và 100 200 bp ở eukaryote]. Mạch mới được tổng hợp theo kiểu gián đoạn này được gọi là mạch chậm [lagging strand].
Trên thực tế, sự tổng hợp cả hai mạch theo cùng hướng vì mạch khuôn chậm được uốn vòng để quay 180o tại chạc ba tái bản, trở nên cùng hướng với mạch khuôn tới.
Mồi RNA
Mạch tới và tất cả những đoạn Okazaki của mạch chậm chỉ có thể được tổng hợp bằng cách kéo dài một mồi đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn. Mồi là một đoạn RNA ngắn, được tổng hợp bởi một phức hợp protein gọi là primosome bao gồm nhiều protein và một enzyme có tên là primase. Ví dụ, ở E. coli, phức hợp primosome bao gồm các Dna B helicase [tách rời hai mạch đơn] và DNA primase [tổng hợp mồi RNA từ khuôn DNA].
Các mồi RNA này sau đó sẽ bị phân hủy bởi RNase và được thay bằng trình tự DNA nhờ vào hoạt động của DNA polymerase. Enzyme ligase sẽ nối liền các đoạn DNA lại với nhau.
Cơ chế dùng mồi là RNA thay vì DNA dường như liên quan đến tính chính xác cao trong tái bản DNA và hoạt tính sửa sai của các DNA polymerase.
Sự tái bản ở eukaryote vẫn còn những điều chưa tường tận nhưng các dữ liệu thu được cho thấy hệ thống này khá gần với hệ thống tái bản ở prokaryote. Khác biệt chủ yếu là ở các loại DNA polymerase tham gia vào quá trình.
Điểm khởi đầu tái bản và giai đoạn khởi đầu:
Vì sự phức tạp trong cấu trúc của chất nhiễm sắc, tốc độ di chuyển của các chạc ba tái bản ở eukaryote chỉ đạt khoảng 50 bp/giây. Với tốc độ này, nếu chỉ sử dụng hai chạc ba tái bản, phải mất 30 ngày mới tái bản xong một phân tử DNA nhiễm sắc thể điển hình của động vật hữu nhũ với kích thước 105 kb. Do đó cần phải có nhiều đơn vị tái bản trong một tế bào, điển hình như ở động vật hữu nhũ là 50.000 100.000 đơn vị tái bản.
Ở eukaryote, có khoảng 20 50 đơn vị tái bản khởi đầu cùng lúc tại mỗi thời điểm, xuyên suốt phase S. Phần tái bản sớm nhất chủ yếu bao gồm nguyên nhiễm sắc chất [euchromatin], tức là phần DNA có hoạt động phiên mã. Trong khi đó, dị nhiễm sắc chất [heterochromatin] được hoạt hóa muộn hơn và phần DNA của tâm động [centromere] và đoạn cuối nhiễm sắc thể [telomere] được tái bản sau cùng. Điều này phản ánh khả năng đáp ứng khác nhau của những cấu trúc nhiễm sắc chất với nhân tố khởi đầu.
Các trình tự khởi đầu ở động vật hữu nhũ chưa được phân lập nhưng người ta tin rằng sự khởi đầu của mỗi đơn vị tái bản có lẽ diễn ra tùy ý bên trong một vùng khởi đầu có thể dài đến vài kb và là một phần của trình tự DNA lặp lại trung bình.
Khác với prokaryote, các đơn vị tái bản của eukaryote chỉ khởi đầu một lần trong mỗi chu trình tế bào. Một protein gọi là nhân tố cho phép [licensing factor] cần thiết cho sự khởi đầu và tái hoạt hóa chỉ có khả năng tiếp cận vào nhân khi màng nhân tan đi, vì thế ngăn chặn được việc tái khởi đầu trước hạn định.
Chạc ba tái bản và hệ thống các enzim tái bản
Trước khi tái bản, DNA phải được tháo khỏi nucleosome tại mỗi chạc ba tái bản. Điều này đã làm chậm sự di chuyển của chạc ba, chỉ còn 50 bp/giây. Sau khi chạc ba tái bản đi qua, các nucleosome được tái lắp ráp từ các histone cũ và histone mới được tổng hợp. Kích thước nhỏ của các đoạn Okazaki [ví dụ 135 bp ở SV40] phản ánh lượng DNA được tháo khỏi mỗi nucleosome khi chạc ba tái bản đi qua. Ngoài sự nhân đôi DNA, các histone cũng phải được nhân lên gấp đôi trong suốt phase S.
Hệ thống các DNA polymerase ở eukaryote phức tạp hơn so với ở prokaryote, bao gồm:
- Polymerase α/primase: Có chức năng tổng hợp mồi cho mạch tới và cho cả những đoạn Okazaki của mạch chậm. Polymerase này tiếp tục kéo dài DNA nhưng nhanh chóng bị thay bởi polymerase δ trên mạch tới và polymerase ε trên mạch chậm. Polymerase α không có hoạt tính exenuclease.
- Polymerase β: Có chức năng giống DNA polymerase I ở prokaryote, nghĩa là tổng hợp đi kèm với sửa sai và hoàn chỉnh mạch mới sau khi mồi RNA được loại bỏ.
- Polymerase δ và polymerase ε : Có chức năng kéo dài DNA. Trong đó khả năng tổng hợp đoạn DNA dài nhất thuộc về polymerase δ với sự trợ giúp của PCNA. Cả hai enzyme này đều có khả năng đọc và sửa sai.
- Polymerase : Được tìm thấy trong ti thể, chức năng chưa rõ.
Ngoài các polymerase kể trên, hệ thống tái bản ở eukaryote còn có sự tham gia của nhiều protein chuyên biệt như PCNA [Proliferating Cell Nuclear Antigen - kháng nguyên trong tế bào đang phân chia] có chức năng hoạt hóa các polymerase δ và ε, các nhân tố tái bản A và C [Replication Factor, RF -A, RF - C] cần cho hoạt động của các polymerase α và δ...
Tái bản ở đoạn cuối nhiễm sắc thể [telomere replication]:
Hai đoạn cuối của nhiễm sắc thể dạng thẳng không thể được tái bản đầy đủ bởi vì không thể kéo dài DNA từ đầu 5 của mạch mới tổng hợp sau khi đã loại bỏ mồi RNA. Do đó thông tin di truyền sẽ mất dần khỏi DNA sau mỗi đợt tái bản.
Để giải quyết vấn đề này, đoạn cuối mỗi nhiễm sắc thể eukaryote bao gồm hàng trăm bản sao một trình tự đơn giản, không mã hóa [ví dụ như TTAGGG ở người] với đầu 3 nhô ra so với đầu 5.
Telomerase là một enzyme duy trì độ dài của telomere. Enzyme này có chứa một phân tử RNA ngắn. Một phần trình tự của RNA này bổ sung với trình tự lặp của telomere, do đó nó có thể hoạt động như một mạch khuôn để kéo dài các trình tự lặp từ đầu 3 tự do của telomere bằng cách tổng hợp rồi dịch chuyển liên tiếp nhiều lần.
Các eukaryote đơn bào, chẳng hạn như nấm men, nhờ vào hoạt động của telomerase mà duy trì telomere, từ đó bảo vệ tế bào khỏi sự mất thông tin di truyền. Thế nhưng ở các sinh vật eukaryote đa bào, ở các tế bào sinh dưỡng, gen mã hóa telomerase bị kỳm hãm. Vì thế, qua mỗi đợt phân bào, các nhiễm sắc thể ngắn dần đi cho đến khi chạm tới các trình tự mã hóa của DNA, tế bào sẽ già đi và chết. Trong nuôi cấy tế bào sinh dưỡng, hầu hết các tế bào chỉ phân chia 30-40 hoặc 50 lần rồi chết.
Ở các tế bào ung thư, sự tái hoạt hóa hoạt động của telomerase khiến cho các tế bào này có khả năng bất tử.